miRNA-20a靶向ATG16L1和ATG7抑制細(xì)胞自噬介導(dǎo)BCG的存活.pdf

1、目的：研究miR-20a對自噬基因ATG16L1和ATG7的靶向調(diào)控作用，及其通過調(diào)控細(xì)胞自噬介導(dǎo)結(jié)核分枝桿菌在巨噬細(xì)胞胞內(nèi)存活的影響。
　　方法：1.利用雷帕霉素、3-MA和BCG處理RAW264.7細(xì)胞后，采用qRT-PCR檢測miR-17-92簇中miR-20a等6種miRNAs的表達(dá)量；通過生物信息學(xué)軟件分析miR-20a對自噬基因ATG16L1和ATG7靶向調(diào)控作用。
　　2.分別將ATG16L13’UTR和ATG

2、73’UTR及其突變體克隆到pMIR-Report質(zhì)粒中，通過雙熒光素酶報告系統(tǒng)和Western blot，驗證miR-20a對ATG16L1和ATG7的靶向調(diào)控作用。
　　3.將miR-20a mimic和miR-20a inhibitor分別轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中，同時利用雷帕霉素與BCG刺激后，通過激光共聚焦顯微鏡、透射電鏡、Western blot方法分別檢測自噬小體分布及自噬相關(guān)蛋白表達(dá)水平，研究miR-20a對自

3、噬過程的調(diào)控作用。
　　4.將miR-20a mimic和miR-20a inhibitor分別轉(zhuǎn)染到RAW264.7細(xì)胞中，同時用BCG和雷帕霉素處理細(xì)胞，利用qRT-PCR檢測各組細(xì)胞中BCG的存活量。研究miR-20a對巨噬細(xì)胞內(nèi)BCG存活量的調(diào)控作用。
　　結(jié)果：1.與對照組相比，雷帕霉素組RAW264.7細(xì)胞的miR-17、miR-18a、miR-20a表達(dá)水平顯著上調(diào)（P<0.05）；3-MA組RAW264.7細(xì)

4、胞的miR-20a表達(dá)水平顯著下調(diào)（P<0.05）。與對照組相比，BCG感染細(xì)胞6h時，miR-20a的表達(dá)水平升高約8倍（P<0.01）。感染時間的延長至48h時，miR-20a的表達(dá)水平較之前有所下降，但仍高于對照組（P<0.05)。
　　2.生物信息學(xué)分析表明，ATG16L1和ATG7是miR-20a的靶基因。雙熒光素酶報告系統(tǒng)結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染miR-20a mimic可明顯抑制ATG16L1的相對熒光素酶活性，其活性下降約1

5、.8倍(P＜0.05)；而轉(zhuǎn)染ATG16L1-mut組相對熒光素酶活性沒有明顯變化。轉(zhuǎn)染miR-20a mimic組ATG7的相對熒光素酶活性受到明顯抑制，下降約1.6倍(P＜0.05)；而ATG7-mut組相對熒光素酶活性沒有明顯變化。
　　結(jié)果：表明，miR-20a可與ATG16L13′-UTR和ATG73′-UTR特異性結(jié)合抑制其表達(dá)。Western blot結(jié)果顯示，miR-20a mimic能明顯抑制ATG16L1和AT

6、G7蛋白的表達(dá)，而miR-20a inhibitor組ATG16L1和ATG7蛋白表達(dá)量明顯升高（P＜0.05），結(jié)果表明miR-20a可在轉(zhuǎn)錄后水平抑制ATG16L1和ATG7的表達(dá)。
　　3.細(xì)胞免疫熒光和透射電鏡實驗結(jié)果表明，轉(zhuǎn)染miR-20a mimic組自噬小體標(biāo)志蛋白LC3均勻分布于細(xì)胞質(zhì)當(dāng)中，自噬小體數(shù)量明顯減少；相反，miR-20a inhibitor組細(xì)胞內(nèi)的點狀自噬小體明顯增多。Western blot檢測LC

7、3的表達(dá)水平，結(jié)果顯示，與對照組相比，miR-20a mimic組LC3-II表達(dá)量明顯減少，LC3II/LC3I比值降低；miR-20a inhibitor組LC3II表達(dá)量明顯升高,LC3II/LC3I比值升高；結(jié)果表明，miR-20a可以通過靶向抑制ATG16L1和ATG7的表達(dá)抑制BCG介導(dǎo)的細(xì)胞自噬過程。
　　4.在RAW264.7細(xì)胞中轉(zhuǎn)染miR-20a mimic、inhibitor、靶基因siRNA，并向每組細(xì)胞中

8、加入1×107/L的BCG共培養(yǎng)24h。實時熒光定量PCR檢測BCG存活量，結(jié)果顯示，miR-20a mimic組的BCG存活量顯著高于正常組（P＜0.01），反之，轉(zhuǎn)染miR-20a inhibitor后BCG存活量顯著低于正常組（P＜0.01）。表明miR-20a可促進(jìn)BCG在巨噬細(xì)胞中的存活。
　　結(jié)論：1.miRNA-20a可靶向抑制ATG16L1和ATG7蛋白的表達(dá)，抑制細(xì)胞的自噬水平，負(fù)向調(diào)控RAW264.7巨噬細(xì)胞的