不同劑量中波紫外線對HaCaT細(xì)胞p62及自噬體形成關(guān)鍵基因Beclin-1、Atg12和Atg3的調(diào)控效應(yīng)研究.pdf

1、背景：中波紫外線主要作用于表皮，角質(zhì)形成細(xì)胞是其重要的靶細(xì)胞，可以引起角質(zhì)形成細(xì)胞內(nèi)的蛋白損傷，而有效地清除損傷蛋白對于維持細(xì)胞內(nèi)環(huán)境的穩(wěn)定至關(guān)重要。p62是一種具有多種生物學(xué)功能的泛素結(jié)合蛋白，其C端的泛素相關(guān)（ubiquitin-associated，UBA）結(jié)合區(qū)可識(shí)別錯(cuò)誤折疊蛋白的泛素部位，p62通過LC3相互作用區(qū)域(LC3-interacting region，LIR)與LC3結(jié)合，并在泛素化蛋白上共定位，形成的多聚泛素化蛋

2、白-p62復(fù)合物通過自噬途徑降解。因此p62是聯(lián)系泛素化蛋白和自噬途徑重要的中介物。自噬是廣泛存在于真核細(xì)胞的生理現(xiàn)象，其主要功能是降解變性蛋白質(zhì)及受損細(xì)胞器。研究發(fā)現(xiàn)角質(zhì)形成細(xì)胞也存在自噬現(xiàn)象，并可減輕角質(zhì)形成細(xì)胞的炎癥。然而，UVB損傷是否可以誘導(dǎo)角質(zhì)形成細(xì)胞的p62蛋白表達(dá)變化，以及損傷細(xì)胞中p62的表達(dá)差異是否與自噬體形成產(chǎn)生生物學(xué)關(guān)聯(lián)，這些問題的答案目前尚不得而知。在這個(gè)研究中，我們對此問題做出初步探索。通過我們的研究有助于初

3、步明確以紫外線損傷是否對角質(zhì)形成細(xì)胞中p62為核心的蛋白降解途徑產(chǎn)生影響。
　　目的：探討不同劑量中波紫外線(UVB)照射培養(yǎng)的HaCaT細(xì)胞后不同時(shí)間點(diǎn)對p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白表達(dá)水平的調(diào)控效應(yīng)。
　　方法：4.5、10和50mJ/cm2UVB照射HaCaT細(xì)胞后4h，使用透射電鏡檢測細(xì)胞超微結(jié)構(gòu)變化。4.5、10和50mJ/cm2UVB照射HaCaT細(xì)胞，照射后加入新鮮培養(yǎng)基繼續(xù)培養(yǎng)4h和12

4、h，同時(shí)設(shè)相同處理但不照射UVB的細(xì)胞為對照細(xì)胞。另設(shè)觀察組，在照射后立即（包括對照細(xì)胞），使用含蛋白酶抑制劑E64D（10μg/L）和胃酶抑素(10μg/L)的培養(yǎng)基孵育4h和12 h，以阻斷對p62的降解。使用Western印跡法測定HaCaT細(xì)胞p62、Beclin-1、Atg12和Atg3蛋白的表達(dá)水平。
　　結(jié)果：4.5、10mJ/cm2UVB照射后，HaCaT細(xì)胞內(nèi)出現(xiàn)自噬體結(jié)構(gòu)，并且這種結(jié)構(gòu)在4.5mJ/cm2照射后

5、更為多見，然而，50mJ/cm2UVB照射后，細(xì)胞中罕有此類結(jié)構(gòu)。50 mJ/cm2UVB照射HaCaT細(xì)胞后4h，p62表達(dá)水平(p62與內(nèi)參的比值為0.473±0.022)較對照細(xì)胞(0.246±0.038)升高(t=15.27，P＜0.05);阻斷溶酶體后，細(xì)胞新生p62水平(0.445±0.035)與阻斷溶酶體的對照(0.244±0.016)相比，仍為上調(diào)(t=7.62，P＜0.05)。在4.5 mJ/cm2UVB照射細(xì)胞后12

6、h，與對照(0.254±0.035)相比，HaCaT細(xì)胞p62表達(dá)上調(diào)(0.497±0.047，t=22.89，P＜0.05);阻斷溶酶體后，與阻斷溶酶體的對照(0.257±0.025)相比，p62表達(dá)水平仍然上調(diào)(0.548±0.051，t=17.42，P＜0.05)。4.5 mJ/cm2和50 mJ/cmUVB照射后4h和12h，對照細(xì)胞和照射細(xì)胞間的Bcclin-1、Atg12和Atg3的表達(dá)差異均無統(tǒng)計(jì)學(xué)意義(P＞0.05)，阻