miRNA-124靶向調控PPP1R13L抑制膠質母細胞瘤增殖和侵潤.pdf

1、背景和目的:
　　目前，腫瘤是危險人類生命健康的頭等殺手。膠質母細胞瘤是星形細胞腫瘤中惡性程度最高的膠質瘤，屬于WHOⅣ級，是一種最常見最致命的中樞神經系統(tǒng)腫瘤之一，年發(fā)生率為4.96/100，000，占所有膠質瘤里面的50％。目前的傳統(tǒng)性的治療手段包括外科手術、放療和化療以及其它綜合性的治療。雖然過去對于膠質母細胞瘤的治療已經取得了很大的進步，但是膠質母細胞瘤患者的生存率依然很低。由于膠質母細胞瘤存在于大腦皮層的白質這種特殊的位

2、置，并且由于膠質母細胞瘤生長速度快、侵潤性強，因此患者病程短，平均存活周期只有大約15個月左右，膠質母細胞瘤患者經診斷后大約95％未經治療的患者生存期不超過3個月。因此，發(fā)展更有效的診斷和治療手段對膠質母細胞瘤進行治療刻不容緩。過去大量的研究表明，膠質母細胞瘤的發(fā)生和發(fā)展和一個復雜的過程，主要涉及到細胞內部原癌基因或者抑癌基因的表達失調，進而導致細胞內信號通路調控的異常激活或者失調。因而，進一步闡明在膠質母細胞瘤的發(fā)生發(fā)展過程中的分子機

3、制將對膠質母細胞瘤的診斷、預防和治療就顯得非常重要。盡管過去對于膠質母細胞瘤在分子水平上的發(fā)生機制進行了大量研究并取得了很多成果，但是對于膠質母細胞瘤的具體分子發(fā)生機制仍然大部分不為人知。
　　MicroRNA是一類非編碼的小分子單鏈RNA，Lee等于1993年首次在線蟲中發(fā)現(xiàn)microRNA，并發(fā)現(xiàn)其參與了對新秀麗線蟲的胚胎后發(fā)育的調節(jié)。后來在多種物種包括動物，植物中都發(fā)現(xiàn)了microRNA的存在。人類中也發(fā)現(xiàn)了多達400多種m

4、icroRNA的存在，據(jù)估計可能在人類中存在多達1000種的microRNA。MicroRNA通過與靶基因mRNA序列的3'非翻譯區(qū)或者編碼區(qū)內含子區(qū)域的特異結合，影響靶基因mRNA的穩(wěn)定性，或者可以直接抑制靶基因的蛋白翻譯，進而調節(jié)靶基因的表達。累積的研究表明，MicroRNA作為一種重要的調節(jié)因子，參與了對細胞分化、增殖、凋亡和代謝等生理過程。由于microRNA對于正常細胞生理活動調節(jié)的重要性，一旦microRNA的調節(jié)失控將引起

5、一系列的分子事件，導致正常細胞細胞周期、增殖、轉移和侵潤等生物學行為改變，促進細胞惡性轉化，導致腫瘤的生成和發(fā)展。因此通過microRNA干預膠質母細胞瘤的發(fā)生以及增殖將成為未來治療膠質母細胞瘤的一種新的策略。
　　MicroRNA-124是一個在神經系統(tǒng)中表達很豐富的miRNA，參與了對神經系統(tǒng)發(fā)育，代謝等重要的生理過程的調節(jié)。在本文的研究中，為了確定microRNA-124在調節(jié)膠質母細胞瘤分化和增殖、侵潤過程中的作用，首先通

6、過比較分析microRNA-124在膠質母細胞瘤組織和正常腦組織的表達差異，然后通過生物信息學對microRNA-124在膠質母細胞瘤細胞中潛在的靶基因進行了分析，并進一步分析了microRNA-124以及靶基因PPP1R13L對膠質母細胞瘤細胞的分化和增殖的調節(jié)。
　　方法和結果:
　　1.microRNA-124在膠質母細胞瘤組織中表達顯著下降:通過實時定量Real-time PCR方法，我們檢測了9例膠質母細胞瘤組織以

7、及7組癌旁腦組織中microRNA-124的表達水平，結果表明，與癌旁腦組織相比，microRNA-124在這9例膠質母細胞瘤組織中的表達都顯著性的下調，下降幅度基本上都達到幾乎3.5倍，說明microRNA-124在膠質母細胞瘤組織中表達顯著下降了。
　　2.microRNA-124負調控了靶基因PPP1R13L的表達:通過采用生物信息學軟件TargetScan對PPP1R13L基因mRNA的3，非翻譯區(qū)進行了潛在microRN

8、A結合位點分析，發(fā)現(xiàn)PPP1R13L基因mRNA的3'非翻譯區(qū)存在兩個microRNA-124結合位點，其中一個位點位于人PPP1R13L基因mRNA的3'非翻譯區(qū)下游約180bp處，在多個物種之間都存在高度保守性。為了進一步驗證microRNA-124能否直接調節(jié)PPP1R13L基因，我們構建了包含PPP1R13L3，非翻譯區(qū)野生型全長序列、保守結合位點突變序列突變體的熒光素酶報告基因載體。通過熒光素酶報告基因檢測實驗證明了，micr

9、oRNA-124能夠顯著的抑制包含PPP1R13L3'非翻譯區(qū)野生型全長序列的報告基因的表達，但是對包含保守結合位點突變序列突變型載體的報告基因的表達沒有影響。通過RT-PCR實驗證明了，在膠質母細胞瘤細胞系U251和U373細胞系中，microRNA-124能夠顯著的抑制PPP1 R13L的mRNA水平。進一步通過Western blot實驗證明了，在膠質母細胞瘤細胞系U251和U373細胞系中，microRNA-124能夠顯著的抑制

10、PPP1R13L的蛋白水平。以上的結果說明，PPP1R13L作為microRNA-124的直接靶基因，被其負調控。
　　3.microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖:通過MTT實驗和克隆形成實驗，發(fā)現(xiàn)相比于過表達對照組，過表達microRNA-124能夠極大的降低膠質母細胞瘤細胞U251和U373的增殖，而過表達microRNA-124抑制物能顯著的增加膠質母細胞瘤細胞U251和U373的增殖。說明m

11、icroRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質母細胞瘤細胞的增殖。
　　4.microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質母細胞瘤細胞的細胞周期運轉:通過流式細胞技術，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，過表達microRNA-124能夠極大的抑制膠質母細胞瘤細胞U251和U373的細胞周期從G1期進入S期，而過表達microRNA-124抑制物能顯著的促進膠質母細胞瘤細胞U251和U373的細胞周期從G1期進入S期。說明microRNA

12、-124靶向PPP1R13L抑制膠質母細胞瘤細胞的細胞周期從G1期進入S期。
　　5.microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質母細胞瘤細胞的侵潤:通過Transwell小室實驗，發(fā)現(xiàn)相比于對照組，過表達microRNA-124能夠極大的抑制膠質母細胞瘤細胞U251和U373的侵潤，而過表達microRNA-124抑制物能顯著的促進膠質母細胞瘤細胞U251和U373的侵潤。同時，也發(fā)現(xiàn)過表達microRNA-124抑制了

13、U251和U373細胞中的MMP-9和MMP-13的表達，過表達microRNA-124抑制物促進了U251和U373細胞中的MMP-9和MMP-13的表達。說明microRNA-124靶向PPP1R13L抑制膠質母細胞瘤細胞的侵潤。
　　主要創(chuàng)新點:
　　1.首次通過Real-Time PCR證明了microRNA-124在膠質母細胞瘤組織中低表達。進一步提示microRNA-124作為膠質母細胞瘤的診斷標記物。
　

14、　2.首次證明microRNA-124通過靶向PPP1R13L抑制膠質母細胞瘤細胞的生長、增殖和遷移。進一步證明了microRNA-124可作為膠質母細胞瘤的干預治療靶點。
　　結論:
　　本研究證明了microRNA-124在膠質母細胞瘤中低表達，并且證明了PPP1R13L為microRNA-124負調節(jié)的靶基因，進而闡明了micorRNA-124通過靶向調節(jié)PPP1R13L抑制膠質母細胞瘤細胞的生長、增殖和侵襲的分子機制