miRNA-22調(diào)控髓母細胞瘤增殖與凋亡的分子機理研究.pdf

1、髓母細胞瘤(medulloblastoma,MB)是最常見的兒童中樞神經(jīng)系統(tǒng)腫瘤(占兒童顱內(nèi)腫瘤的12％-25%),常起源于小腦蚓部或后髓帆,為WHOIV級腫瘤。兒童MB發(fā)病的高峰是3歲和7歲,MB在成人發(fā)病率較低(僅0.4%-1%),發(fā)病多在20-40歲。男女發(fā)病比約為1.3:1。臨床表現(xiàn)以顱內(nèi)壓增高的癥狀為主,頭痛伴有持續(xù)的嘔吐,當腫瘤壓迫小腦時尚會出現(xiàn)共濟失調(diào)的體征,腫瘤還可隨腦脊液向脊髓蛛網(wǎng)膜下腔播散,使患者病情急劇惡化。目前治

2、療方法以手術(shù)輔以放化療的綜合治療為主,這在很大程度上改善了患者預(yù)后,但隨之而來的是長期放化療的毒副作用,如神經(jīng)內(nèi)分泌障礙、生長發(fā)育遲緩、神經(jīng)心理及認知功能障礙等。因此研究MB發(fā)病的分子機制,探索可用于治療的分子生物學(xué)新靶點有著重要的意義。
　　已有研究表明microRNAs是一類具有轉(zhuǎn)錄后調(diào)控作用的20-24個核苷酸的內(nèi)源性非編碼小RNA,廣泛參與到細胞的增殖、凋亡、分化、發(fā)育以及腫瘤的發(fā)生和發(fā)展。Ferretti E等對34例M

3、B及14例正常小腦組織利用實時定量PCR技術(shù),建立了MB miRNA表達文庫,其中位于染色體17p13.3的miR-22呈現(xiàn)低表達,而17p的缺失是MB染色體異常的一種重要的表現(xiàn)形式,這初步提示了miR-22在髓母細胞瘤的發(fā)生、發(fā)展中起著重要的作用。為進一步深入研究miR-22參與MB發(fā)病的分子機制,我們進一步擴大MB樣本量加以驗證,并進行miR-22生物學(xué)功能分析,下游靶點篩查、驗證及生物學(xué)功能分析,初步闡明miR-22在髓母細胞瘤發(fā)

4、病過程中的生物學(xué)作用。
　　實驗方法:
　　第一部分:選取MB臨床標本、原代培養(yǎng)細胞及MB細胞系利用qRT-PCR的方法檢測miR-22表達情況。并采用熒光原位雜交(Fluoresence in situ hybridization,FISH)技術(shù),初步探討染色體17p位點是否存在雜合性缺失。
　　第二部分:體外培養(yǎng)髓母細胞瘤細胞系并利用慢病毒表達載體進行上調(diào)和下調(diào)miR-22的表達,行CCK-8檢測細胞增殖活性,并行

5、流式細胞儀檢測細胞凋亡。同時采用荷瘤小鼠模型在體研究miR-22過表達后對MB的影響。對過表達miR-22的MB細胞系行基因芯片篩查分析,并采用雙熒光素酶報告系統(tǒng)驗證miR-22新靶點。
　　第三部分:在MB臨床標本、原代細胞及MB細胞系中檢測PAPST1的表達,并在MB細胞系中下調(diào)PAPST1表達后CCK-8檢測細胞增殖活性的變化。
　　結(jié)果:
　　1.miR-22在MB中低表達
　　(1)70%(19/27)

6、的MB臨床標本以及3株MB細胞系qRT-PCR結(jié)果提示存在miR-22的低表達(正常小腦組織表達水平的20%以下)。
　　(2)19%(5/27)的MB標本存在17p13.3的丟失。
　　2.miR-22表達對MB細胞系增殖與凋亡的影響
　　(1)上調(diào)miR-22可以抑制MB細胞系的增殖活性,相反下調(diào)其表達可以增強MB細胞系的增殖活性。
　　(2)miR-22過表達可以促進MB細胞系的凋亡。
　　(3)mi

7、R-22過表達可以抑制裸鼠腫瘤的生長促進瘤細胞凋亡。
　　(4)PAPST1是miR-22的生物學(xué)新靶點
　　基因芯片提示miR-22上調(diào)后顯著抑制了PAPST1的表達,雙熒光素酶報告實驗證實PAPST1是miR-22的生物學(xué)新靶點。
　　3.PAPST1在MB中的表達及其對MB細胞增殖特性的影響
　　(1)67%(18/27)的MB臨床標本以及2株MB細胞系qRT-PCR結(jié)果提示存在PAPST1的高表達(正常小

8、腦組織表達水平的2倍以上)。
　　(2)PAPST1免疫組織化學(xué)顯示棕褐色的顆粒分布于細胞漿,且著色明顯強于正常小腦組織。
　　(3)下調(diào)PAPST1表達后MB細胞系增殖活性降低。
　　結(jié)論:miR-22在髓母細胞瘤中常表達下調(diào),其表達水平通常與髓母細胞瘤體外增殖活性呈負相關(guān),過表達miR-22在體內(nèi)、體外均可以誘導(dǎo)髓母細胞瘤凋亡,抑制腫瘤生長。
　　PAPST1是miR-22的新靶點,在髓母細胞瘤中普遍高表達,