實驗性分子靶向治療膠質母細胞瘤.pdf

1、惡性膠質瘤是最常見的中樞神經系統(tǒng)腫瘤，由于其很高的致殘、致死和復發(fā)率，已成為威脅人類健康的主要疾病之一。該類腫瘤患者即使經過手術、放療和化療等系統(tǒng)治療，預后仍然較差。其中，最惡性的多形性膠質母細胞瘤患者經綜合治療后，其總體中位生存期也僅為12-15個月。一旦復發(fā)，該類患者的總體生存時間也僅為6-8個月。膠質瘤具有豐富的血管生成、很高的增殖能力和侵襲性。腫瘤細胞獲得對抗細胞調亡的能力是其中的關鍵環(huán)節(jié)之一。因此，尋找膠質瘤細胞發(fā)生與進展中的

2、關鍵分子，并針對該分子進行實驗性靶向治療，具有潛在的臨床應用價值和廣泛的社會意義。
　　14-3-3蛋白是一類高度保守的小分子多功能酸性二聚體蛋白，存在于幾乎所有真核生物中。在人類，它們有由不同基因編碼的7個亞型，分別命名為β、η、ζ、ε、γ、θ和σ。14-3-3蛋白能通過磷酸化的絲氨酸/蘇氨酸序列的方式與目標分子形成同源或異源二聚體。通過募集配體分子，14-3-3蛋白參與了調節(jié)多個細胞過程，包括有絲分裂、凋亡、細胞周期和侵襲。這

3、些研究提示，14-3-3蛋白可能參與了腫瘤細胞的多條信號通路。我們前期的研究發(fā)現，14-3-3蛋白在人腦膠質瘤中呈強陽性表達，而在膠質細胞中則無表達或僅有弱表達，并與人腦膠質瘤的惡性級別及預后具有密切的相關性。用14-3-3蛋白特異性的抑制物difopein,抑制14-3-3蛋白與其配體分子之間的相互作用，或通過小干涉RNA下調14-3-3蛋白的表達，誘導了膠質母細胞瘤細胞的凋亡，提示14-3-3蛋白在細胞生存中具有重要作用，并為抑制1

4、4-3-3蛋白能夠增加腫瘤的凋亡敏感性提供了依據。為進一步明確這種作用是由一個或多個14-3-3蛋白亞型引起的，我們進行了亞型特異性的表達檢測。對14-3-3蛋白在星形膠質瘤的各亞型表達檢測發(fā)現，14-3-3β和η在膠質瘤細胞中呈特異性高表達，并與膠質瘤的惡性級別明顯相關。14-3-3ζ和ε在膠質瘤細胞和正常膠質細胞中均有表達，在膠質瘤細胞中的表達明顯高于正常膠質細胞，并與膠質瘤的惡性級別明顯相關。近年的多項研究還提示，14-3-3ze

5、ta在肺癌、乳腺癌等多類腫瘤的發(fā)生與進展中發(fā)揮了重要作用。目前，國內外尚無14-3-3zeta在膠質母細胞瘤的功能研究?；诖?，本課題從以下6個方面進行了探討。
　　1．14-3-3zeta蛋白在膠質母細胞瘤組織中的表達及意義
　　采用免疫組織化學方法檢測了12例正常腦組織和47例人腦膠質母細胞瘤石蠟標本中14-3-3zeta蛋白的表達情況。結果顯示，14-3-3zeta蛋白主要表達于正常腦組織中的神經元胞體和突起，而絕大多

6、數膠質細胞中無14-3-3zeta蛋白的表達，僅在極少量的膠質細胞中可見弱陽性表達。14-3-3zeta蛋白主要表達于膠質母細胞瘤細胞的胞漿，呈明顯的強陽性表達，其表達率約為74.5％(35/47)。結合相關研究，14-3-3zeta蛋白在膠質母細胞瘤中的強陽性表達提示其可能在膠質母細胞瘤中發(fā)揮了重要作用，這為下一步的研究奠定了基礎。
　　2．14-3-3zeta蛋白表達與膠質母細胞瘤患者預后的相關性研究
　　47例膠質母細

7、胞瘤患者依據14-3-3zeta蛋白的表達分為兩組：14-3-3zeta陽性組(n=35)和14-3-3zeta陰性組(n=12)。收集每位患者的臨床病理特征，并展開定期臨床隨訪。通過Kaplan-Meier生存期分析、單因素和多因素回歸分析，用以確定預后的相關因子。結果表明，14-3-3zeta陽性組患者的2年總體中位生存期(12.9月)和生存率(8.6％)明顯低于14-3-3zeta陰性組患者的2年總體中位生存期(17.9月)和生存

8、率(16.7％)(P=0.019)。14-3-3zeta的陽性組患者的術后復發(fā)間隔(5.9月)也短于14-3-3zeta陰性組患者(8.3月)(P=0.002)。單因素和多因素的方差分析提示，14-3-3zeta的陽性表達是重要的預后因子。因此，我們認為14-3-3zeta可作為判斷膠質母細胞瘤患者預后的一個潛在指標。
　　3.14-3-3zeta蛋白陽性表達與膠質母細胞瘤細胞增殖和凋亡的相關性研究
　　21例膠質母細胞瘤標

9、本分別進行14-3-3zeta、Ki67免疫組織化學染色和TUNNEL染色，分析14-3-3zeta蛋白的表達(14-3-3zeta免疫組織化學評分表示)與膠質母細胞瘤細胞增殖與凋亡的相關性。腫瘤細胞的增殖指數(PI)用Ki67陽性細胞數表示，凋亡指數(AI)用TUNNEL陽性細胞數表示。結果提示，14-3-3zeta的陽性表達率為76.2％(16/21)，免疫組織化學評分為6.29±3.57。增殖指數Ki67在所有腫瘤樣本均有表達(5

10、0.08±13.98％)，表達范圍從27.8％到82.4％。凋亡指數AI也表達于所有腫瘤樣本中(3.88±1.41％)，表達范圍從1.0％到6.4％。14-3-3zeta免疫組織化學評分與增殖指數PI呈正相關(r=0.870,P<0.001),與凋亡指數AI呈負相關(r=-0.975,P<0.001)。并且14-3-3zeta陽性組腫瘤標本的凋亡指數(3.47±1.19％)明顯低于14-3-3zeta陰性組(5.2±1.13％,t=-2

11、.77,P=0.012)。這些結果提示14-3-3zeta很有可能參與了膠質母細胞瘤細胞的增殖與凋亡。
　　4．抑制14-3-3zeta蛋白表達對膠質母細胞瘤細胞體外增殖、凋亡和侵襲的影響
　　以U251和U87細胞作為研究對象，通過逆轉錄病毒將14-3-3zetaRNAi片段和無關序列轉入膠質母細胞瘤細胞，構建14-3-3zetaRNAi穩(wěn)定轉染細胞系。RT-PCR和Westernblot證實，14-3-3zetaRNAi

12、片段足夠下調14-3-3zeta蛋白的表達。通過MTT實驗、平板克隆實驗、流術細胞儀(FCM)、細胞周期測定和Matrigel侵襲實驗，檢測14-3-3zeta基因表達下調后，膠質母細胞瘤細胞的生物學行為改變。MTT實驗結果提示，與膠質母細胞瘤空白對照組和無關序列組相比，14-3-3zeta干涉組細胞的增殖能力明顯下降(P<0.05)，對U251和U87細胞接種7天后的抑制率分別為57.5±4.2％和53.6±3.4％。平板克隆實驗結果

13、提示，與空白對照組和無關序列組相比，下調14-3-3zeta基因的表達后，膠質母細胞瘤細胞U251的克隆形成能力分別降低了1.91和2.03倍，U87細胞的克隆能力下降了1.89和1.95倍。FCM結果提示，與空白對照組(0.8±0.1％)和無關序列組(2.2±0.4％)相比，14-3-3zeta干涉組細胞中早期凋亡和晚期凋亡均顯著增多(P<0.05)。U251細胞的早期凋亡和晚期凋亡率分別達到了10.4±1.8％和15.1±2.3％。

14、U87細胞的早期凋亡和晚期凋亡率分別達到了11.4±1.6％和12.6±2.8％,與空白對照組(0.5±0.1％)與無關序列組(1.5±0.4％)細胞相比，均有顯著提高(P<0.05)。FCM測定細胞周期顯示，與空白對照組與無關序列組細胞相比，14-3-3zeta干涉組細胞(U251和U87)G0/G1期細胞顯著增多，G2/M期和S期細胞明顯減少。Matrigel侵襲實驗結果顯示，與空白對照組(U251：46.3±7.1；U87：57.

15、1±6.9)和無關序列組(U251：49.2±8.4；U87：62.2±7.8)細胞相比，14-3-3zeta干涉組細胞的侵襲能力顯著下降(U251：24.1±3.2；U87：26.3±3.0)。為探索抑制14-3-3zeta基因后腫瘤細胞生物行為學改變的可能分子機制，我們檢測了14-3-3zeta基因敲除后，與膠質母細胞瘤發(fā)生和進展相關分子的表達情況。結果提示，14-3-3zeta基因敲除引起了癌基因Cox2,c-Myc,Surviv

16、in和β-catenin以及侵襲相關基因E-cadherin的表達下調，而細胞周期相關基因CyclinD1未發(fā)生明顯變化，盡管細胞周期停滯確實存在。這些結果提示我們，14-3-3zeta基因敲除后引起膠質母細胞瘤生物學行為的改變可能是一個多基因參與的復雜過程，更進一步的相關分子機制仍需闡明。我們的結果提示，抑制14-3-3zeta的表達能夠顯著降低膠質母細胞瘤的增殖和侵襲能力，誘導膠質瘤細胞凋亡和細胞周期停滯。以14-3-3zeta蛋白

17、為靶點是治療膠質母細胞瘤的一個潛在手段。
　　5．抑制14-3-3zeta蛋白表達對膠質母細胞瘤細胞裸鼠體內成瘤性的影響
　　在裸鼠成瘤實驗中，我們將U87-KD細胞(穩(wěn)定轉染14-3-3zetaRNAi片段)、U87-SCR細胞(穩(wěn)定轉染無關序列)和U87-PAR細胞(空白對照)分別接種于裸鼠右側股部建立裸鼠移植瘤模型。每周觀察并記錄腫瘤的生長情況，測定腫瘤最大徑與最小徑，計算腫瘤體積并繪制腫瘤生長曲線。6周后將裸鼠處死，

18、稱腫瘤重量。結果顯示，與無關序列組和空白對照組相比，14-3-3zeta干涉組裸鼠形成腫瘤的時間延遲，生長緩慢，腫瘤體積及瘤重均有明顯減少(U87-PAR：1.63±0.37g；U87-SCR：1.58±0.41g；U87-KD：0.73±0.26g；P<0.05)。Ki67免疫組織化學染色和TUNNEL染色陽性細胞數分別表示腫瘤增殖指數與凋亡指數。結果顯示，與空白對照組(Ki67：36.2±6.1；TUNNEL：3.7±1.5)和無關

19、序列組(Ki67：34.5±5.5；TUNNEL：4.5±1.6)相比，14-3-3zeta抑制組的瘤組織凋亡指數增加，增殖指數下降(Ki67：18.3±3.1；TUNNEL：24.8±4.9；P<0.05)。上述結果提示，抑制14-3-3zeta的表達減緩移植瘤的生長，可能是通過降低瘤細胞的增殖和誘導瘤細胞的凋亡來實現的。
　　6．14-3-3zeta蛋白在膠質母細胞瘤干細胞中的表達及潛在的生物學意義
　　為了進一步明確1

20、4-3-3zeta對膠質母細胞瘤的作用，我們從12例膠質母細胞瘤組織中分離培養(yǎng)了5株膠質母細胞瘤干細胞。首先將腫瘤組織消化成單細胞，用腫瘤干細胞培養(yǎng)液培養(yǎng)直至形成克隆球，進行CD133染色。去除腫瘤干細胞培養(yǎng)液后，換成含10％血清的正常培養(yǎng)基，進行分化實驗(GFAP和β-tubulin染色)。同時將1000個膠質母細胞瘤細胞種植于裸鼠，在裸鼠皮下形成可見的腫瘤，取瘤組織重新進行腫瘤干細胞培養(yǎng)依然能夠形成克隆球。將培養(yǎng)鑒定的腫瘤干細胞進行

21、14-3-3zeta免疫細胞化學染色。結果提示，膠質母細胞瘤干細胞中14-3-3zeta呈陽性表達。14-3-3zeta蛋白可能在扮演腫瘤起源的腫瘤干細胞中發(fā)揮了重要作用，但具體作用仍需進行深入研究。
　　綜上所述，本研究首次在國內外證實14-3-3zeta蛋白在人腦膠質母細胞瘤形成、發(fā)展以及侵襲過程中的發(fā)揮了關鍵作用，其作用機制可能是通過抑制腫瘤細胞的凋亡來實現的。在腫瘤干細胞中其表達陽性提示14-3-3zeta可能作用于腫瘤干