MINA在膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖和腫瘤生長中的作用及機制研究.pdf

1、膠質(zhì)母細胞瘤（glioblasoma，GBM）為IV級、惡性程度最高的膠質(zhì)瘤，具有高增殖、高浸潤、高復發(fā)，手術難以切除、放療化療抵抗等特點，目前療效不甚理想，尋找新的治療靶點尤為迫切。MINA（MYC induced nuclear antigen）屬于組蛋白去甲基化酶JMJD家族，具有H3K9me3去甲基化功能，在多種腫瘤中高表達且預示著較差的病人預后，然而目前對MINA在腫瘤中的具體作用及作用機制尚不清楚。本論文主要研究了MINA在

2、膠質(zhì)母細胞瘤細胞中所扮演的角色，從體外細胞水平及體內(nèi)實驗動物水平深入探索了MINA對膠質(zhì)母細胞瘤細胞增殖與腫瘤生長的影響及潛在的分子機制，并結合臨床數(shù)據(jù)庫及臨床組織樣本分析，對MINA作為膠質(zhì)母細胞瘤治療靶標的可行性進行了評估，揭示了MINA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中可能扮演的原癌基因的角色。主要研究結果如下：
　　1、MINA在膠質(zhì)母細胞瘤細胞中廣泛表達，且MINA的表達與膠質(zhì)母細胞瘤患者的預后成負相關
　　為了探討MINA在

3、膠質(zhì)母細胞瘤中扮演的角色，我們首先在若干膠質(zhì)母細胞瘤細胞系包括LN-229、U-251 MG、U-87 MG、U-118 MG和A-172中檢測分析了MINA的表達情況。我們分別利用RT-PCR和Western blot檢測了MINA在上述細胞系中的mRNA和蛋白表達水平。結果發(fā)現(xiàn)MINA在膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中普遍表達，且相對惡性的細胞中MINA的表達量高于相對良性細胞的MINA表達量。通過病理分析多個膠質(zhì)母細胞瘤臨床組織樣本和其相應癌

4、旁組織樣本中MINA的表達情況，我們發(fā)現(xiàn)，膠質(zhì)母細胞瘤臨床組織樣本中MINA的表達量顯著高于其相應癌旁組織樣本中MINA的表達量，且在癌旁組織樣本（接近于正常組織）中，MINA幾乎不表達。進一步地，我們利用R2檢索多個膠質(zhì)母細胞瘤及膠質(zhì)瘤預后數(shù)據(jù)庫，分析MINA的表達與患者預后及腫瘤分級的關系，結果發(fā)現(xiàn)高表達MINA的膠質(zhì)母細胞瘤和膠質(zhì)瘤病人有著更差的預后情況，MINA表達量越高患者生存時間越短，越容易復發(fā)；且MINA的表達量與膠質(zhì)瘤的

5、分級成正相關，等級越高惡性程度越高的膠質(zhì)瘤中MINA的表達量也越高。這些結果暗示MINA在腫瘤發(fā)生、發(fā)展過程中極有可能扮演著一個原癌基因的角色，為我們后續(xù)進一步研究MINA在膠質(zhì)母細胞瘤中的作用奠定了基礎并提供了現(xiàn)實意義。
　　2、MINA調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤細胞生長、增殖和克隆形成能力
　　依據(jù)MINA可能在膠質(zhì)母細胞瘤中扮演原癌基因角色的結論，我們對MINA在膠質(zhì)母細胞瘤中扮演的角色進行了探討與驗證。我們利用慢病毒介導的短發(fā)

6、夾RNA（short hairpin RNA,shRNA）干擾技術在兩個膠質(zhì)母細胞瘤細胞系LN-229和U-87 MG中下調(diào)了MINA的表達，并隨后在下調(diào)MINA表達后的膠質(zhì)母細胞瘤細胞中進行了生物學功能性分析。首先我們檢測了下調(diào)MINA對膠質(zhì)母細胞瘤細胞生長和活力的影響。通過鏡檢及MTT細胞生長活力檢測實驗，我們發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MINA的表達之后，膠質(zhì)母細胞瘤細胞的生長活力明顯受到抑制且MINA對膠質(zhì)母細胞瘤細胞生長的影響存在著一定的劑量關

7、系，MINA表達量越高，膠質(zhì)母細胞瘤細胞的生長越快。進一步地，我們進行了5-溴脫氧尿嘧啶核苷（5-Bromo-2-deoxyUridine，BrdU）熒光染色實驗，檢測了干擾MINA之后膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖能力。結果發(fā)現(xiàn)，對照組比干擾組具有明顯更高的BrdU陽性率，說明干擾MINA之后，膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖能力受到了顯著抑制。此外，我們還對干擾MINA之后的膠質(zhì)母細胞瘤細胞進行了Soft-Agar軟瓊脂實驗，檢測其克隆形成能力。結果

8、顯示，無論是克隆形成的數(shù)量還是大小，干擾組的數(shù)值都顯著小于對照組。說明干擾MINA之后，膠質(zhì)母細胞瘤細胞的克隆形成能力受到了顯著抑制。這些結果說明，MINA對膠質(zhì)母細胞瘤細胞的生長、增殖和克隆形成至關重要。
　　為了對MINA在膠質(zhì)母細胞瘤細胞生長、增殖和克隆形成過程中的重要作用提供更多的證據(jù)支撐，我們在干擾MINA后的膠質(zhì)母細胞瘤細胞中通過過表達手段回復了MINA的表達，以期檢測其生長、增殖和克隆形成能力是否得以回復。我們根據(jù)s

9、hMINA＃2短發(fā)夾RNA的靶向作用位點，設計了可以成功過表達而不被shMINA#2靶向性降解且蛋白序列與野生型MINA無差別的MINA-R，并驗證了在干擾MINA之后，回復MINA-R可顯著回復MINA的表達。利用MTT法檢測細胞生長曲線，BrdU法檢測細胞增殖，Soft-Agar軟瓊脂實驗檢測細胞克隆形成能力等，我們發(fā)現(xiàn)，在干擾MINA之后再次回復MINA成功地挽救了細胞的生長、增殖和克隆形成。這些結果更加強力地說明MINA確實起到

10、了促進膠質(zhì)母細胞瘤細胞生長、增殖和克隆形成的作用。
　　3、MINA調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤的細胞周期進程
　　為了進一步探索MINA如何調(diào)節(jié)膠質(zhì)母細胞瘤細胞的增殖，我們選取了干擾MINA后3天和5天的LN-229細胞送去生物公司進行了Microarray微陣列基因芯片測序，大數(shù)據(jù)分析了下調(diào)MINA之后基因表達的變化情況。通過基因本體（Gene Ontology，GO)分析KEGG通路分析我們發(fā)現(xiàn)，因干擾MINA而下調(diào)的基因顯著富集

11、在與細胞周期進程相關的基因本體項以及“CDK調(diào)控的DNA復制”通路。利用碘化丙啶（propidium iodide，PI）對DNA進行染色，通過流式細胞術甄別細胞所處的周期時期的方法，我們進一步探索了MINA的表達變化對膠質(zhì)母細胞瘤細胞的周期進程的影響。結果發(fā)現(xiàn)，干擾MINA之后的LN-229和U-87MG細胞周期均在G1期和G2/M期有顯著的PI染色峰，其所占比率明顯高于對照組，且二者的S期比率明顯減少至幾乎沒有，說明下調(diào)MINA之后

12、二者的細胞周期明顯阻滯在了G1期和G2/M期，DNA的復制合成明顯受到了抑制。并且，在干擾MINA之后再次回復MINA的表達使細胞復制期各階段的占比回復到了與對照組相近的表型，說明回復MINA成功促使了細胞周期從G1期到S期再到G2/M期的轉換。這些結果說明MINA的膠質(zhì)母細胞瘤細胞周期的進程至關重要。
　　4、MINA通過轉錄激活Cyclins和CDKs的表達從而調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤細胞周期進程
　　為了對MINA如何調(diào)控細胞

13、周期進程的分子機制獲得更深入的了解，我們進一步分析了我們的Microarray基因芯片數(shù)據(jù)，發(fā)現(xiàn)下調(diào)MINA之后，一些細胞周期蛋白（Cyclins）基因和細胞周期蛋白依賴激酶（CDKs）基因被顯著下調(diào)，且3天和5天的結果呈現(xiàn)一個時間累積效應。進一步的驗證結果顯示，下調(diào)MINA的表達導致細胞周期相關基因CCNB，CCND，CCNE，CDK1，CDK2和CDK4在mRNA水平顯著的下調(diào)；下調(diào)MINA之后，Cyclin B1，D1，E2和CD

14、K1，CDK2以及CDK4蛋白水平的表達同樣受到了顯著的抑制。此外，干擾MINA之后再次回復MINA的表達成功反轉了這一抑制效應，并顯著上調(diào)了這些蛋白的表達。Cyclin D/CDK4復合體以及Cyclin E/CDK2復合體為細胞周期從G1期到S期的進程所需，而Cyclin B/CDK1復合體則對細胞周期通過G2/M檢查點至關重要。MINA的表達情況直接影響著這些復合體的表達，進一步說明MINA調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤細胞的細胞周期進程。

15、r>　　進一步地，我們利用染色質(zhì)免疫共沉淀（chromatin immunocoprecipitation，ChIP）結合定量PCR（quantitative real-time PCR，qPCR）技術（ChIP-qPCR），檢測MINA能否結合在這些細胞周期相關基因的啟動子上。結果發(fā)現(xiàn)，和我們的預期一致，MINA分別在CCNE2啟動子上的-1408～-1289區(qū)域、CDK2啟動子上的-476～-366區(qū)域、CCND1啟動子上的-469

16、~-363區(qū)域、CDK4啟動子上的-379～-293區(qū)域和+604～+762區(qū)域以及CDK1啟動子的-1094～-1021區(qū)域顯著富集，其中CCNE2、CDK2、CDK4的富集尤為明顯。為了進一步驗證我們的結果，我們進行了雙熒光
　　素報告系統(tǒng)實驗（dual luciferase reporter assay）。結果發(fā)現(xiàn)，下調(diào)MINA的表達后，CDK2和CDK4啟動子的活性明顯降低，說明MINA可以增強細胞周期相關基因的啟動子活性

17、。
　　上述實驗結果證實，MINA通過轉錄激活Cyclins和CDKs的表達從而調(diào)控膠質(zhì)母細胞瘤細胞周期進程。
　　5、MINA通過其JmjC結構域介導的H3K9去甲基化調(diào)控細胞周期相關基因的表達
　　越來越多的證據(jù)表明，組蛋白的表觀遺傳修飾在基因的轉錄激活或抑制中扮演重要的角色，我們進一步探索了MINA對細胞周期相關基因表達的轉錄調(diào)控是否與H3K9的去甲基化有關。首先，我們檢測了下調(diào)MINA之后 LN-229細胞的H

18、3K9甲基化狀態(tài)。Western blot結果顯示，下調(diào)MINA之后H3K9上的三甲基化水平顯著升高，而一甲基化水平顯著降低，證明MINA確實可以介導H3K9從三甲基到一甲基的去甲基化。
　　接著，我們刪除了維持MINA去甲基化功能必不可少的JmjC結構域，構建了同樣具有shMINA#2靶定抗性的MINAΔJmjC-R。利用缺失-功能性回復/失活回復的手段，我們研究了shMINA#2、shMINA#2/MINA-R以及shMINA

19、#2/MINAΔJmjC-R處理組中H3K9的甲基化狀態(tài)以及細胞周期關鍵蛋白的表達情況。結果發(fā)現(xiàn)，H3K9me1、Cyclin E2、CDK2以及CDK4的表達水平隨MINA的下調(diào)而下調(diào)，H3K9me3反之，說明MINA的下調(diào)阻滯了H3K9由三甲基到一甲基的去甲基化，從而不能激活細胞周期相關蛋白的表達；在干擾MINA后再次回復有功能的MINA反轉了這一結果，促使H3K9成功地去甲基化，從而挽救了細胞周期相關蛋白的表達。然而，干擾MINA

20、之后回復JmjC結構域缺失的MINA突變體卻對上述蛋白的表型幾乎未產(chǎn)生任何影響，說明MINA依賴其JmjC結構域行使表觀遺傳的轉錄調(diào)控功能。
　　6、MINA通過調(diào)控細胞周期影響膠質(zhì)母細胞瘤的生長
　　為了研究MINA在膠質(zhì)母細胞瘤生長中的作用，我們通過動物實驗進行了體內(nèi)水平的探究。我們利用NOD/SCID荷瘤免疫缺陷小鼠模型進行了皮下成瘤實驗。結果顯示，與Control對照組相比，下調(diào)MINA之后的LN-229細胞成瘤能力

21、明顯減弱，腫瘤的生長受到顯著抑制，且所成腫瘤的體積和重量的值都遠遠低于Control對照組；干擾MINA之后再次回復有功能的MINA-R則成功挽救了LN-229細胞的成瘤能力，腫瘤的生長和移植瘤體積及重量都明顯得到回復；然而，經(jīng)過同樣的生長時間，干擾MINA之后再次回復去甲基化功能缺失的MINAΔJmjC-R的LN-229細胞則未能反轉shMINA#2 LN-229細胞的成瘤抑制，無論是腫瘤的生長還是移植瘤的體積、重量，均顯示顯著比Co

22、ntrol組和shMINA#2/MINA-R組更低的水平。這些結果說明MINA對膠質(zhì)母細胞瘤的體內(nèi)成瘤及腫瘤生長至關重要，且MINA對膠質(zhì)母細胞瘤成瘤及腫瘤生長的調(diào)控同樣依賴其JmjC結構域所起的功能。
　　為了驗證我們研究所得出的體外機制在是否同樣適用于體內(nèi)腫瘤生長過程，我們通過生物學和病理學分析，進一步對體內(nèi)機制進行了探索與驗證。結果顯示，體內(nèi)所生成的移植瘤中蛋白的表達情況與體外培養(yǎng)的膠質(zhì)母細胞瘤細胞系中蛋白的表達情況一致：與

23、Control對照組相比，下調(diào)MINA之后的LN-229所長成的移植瘤中，Cyclin B1、D1、E2，CDK1、2、4以及H3K9me1的表達均顯著下調(diào)，而H3K9me3的表達顯著上升；下調(diào)MINA后回復有去甲基化功能的MINA-R成功反轉了這一表型；然而下調(diào)MINA后回復去甲基化活性缺失的MINAΔJmjC-R則不能反轉這一表型；Control組和shMINA#2/MINA-R組的腫瘤組織比shMINA#2組和shMINA#2/M

24、INAΔJmjC-R組的腫瘤組織顯示出更加惡性的表征，且腫瘤組織的惡性程度與功能性的MINA表達正相關。此外，功能性MINA的表達還和細胞增殖標記物 Ki67的表達正相關，二者呈現(xiàn)同步的變化情況，且與腫瘤組織的惡性程度一致，說明MINA對膠質(zhì)母細胞瘤的成瘤和生長至關重要，暗示MINA在膠質(zhì)母細胞瘤中很可能扮演著原癌基因的角色。
　　綜上所述，MINA的表達與膠質(zhì)母細胞瘤患者的預后呈負相關，MINA通過對H3K9的去甲基化轉錄激活細