MicroRNA-184抑制膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲及靶向調(diào)控TNFAIP2表達的實驗研究.pdf

1、目的：檢測microRNA-184(miR-184)、TNFAIP2在人腦膠質(zhì)瘤組織標本及膠質(zhì)瘤細胞株及非瘤腦組織標本中的表達情況；探討miR-184對膠質(zhì)瘤細胞增殖、侵襲及凋亡等功能的影響；揭示miR-184和TNFAIP2在膠質(zhì)瘤中的相互作用關(guān)系；為尋找到診斷和治療膠質(zhì)瘤及判斷膠質(zhì)瘤預(yù)后和復(fù)發(fā)情況的新的靶基因奠定基礎(chǔ)。
　　方法：
　　1.根據(jù)基因芯片技術(shù)檢測膠質(zhì)瘤細胞株SHG139中miRNAs的表達譜，選擇表達下調(diào)的

2、具有統(tǒng)計學(xué)意義的miR-184作為研究對象。應(yīng)用qRT-PCR方法進一步驗證miR-184在膠質(zhì)瘤細胞株和非瘤腦組織中的表達情況。
　　2.擴大膠質(zhì)瘤組織標本后，再次通過實時qRT-PCR方法檢測miR-184在49例膠質(zhì)瘤組織標本中的表達情況。
　　3.通過Lipofectamine2000脂質(zhì)體法將miR-184 mimics、miR-184 inhibitor和negative control oligonucleot

3、ide轉(zhuǎn)染到膠質(zhì)瘤細胞株U87和U251中。通過CCK-8細胞增殖試驗檢測miR-184對膠質(zhì)瘤細胞U87和U251的增殖影響；應(yīng)用Annexin VPE Apoptosis Detection Kit PE和流式細胞儀檢測U87及U251細胞的早期凋亡率；通過劃痕試驗以及Transwell試驗檢測miR-184對人腦膠質(zhì)瘤細胞U87和U251遷移侵襲能力的影響。
　　4.查閱文獻及通過分析生物信息軟件（Targetscan、mi

4、Rwalk、miRnada）發(fā)現(xiàn)認為miRNA-184可與TNFAIP2(腫瘤壞死α誘導(dǎo)蛋白2)的3，-UTR區(qū)結(jié)合。通過qRT-PCR技術(shù)檢測TNFAIP2在81例膠質(zhì)瘤組織、5株膠質(zhì)瘤細胞和5例非瘤腦組織中的表達情況；再通過Western blot方法檢測TNFAIP2蛋白在5株膠質(zhì)瘤細胞中的表達情況；miR-184 mimics、inhibitor和negative control轉(zhuǎn)染U87和U251細胞后再通過Western b

5、lot方法檢測TNFAIP2蛋白表達情況。
　　5.使用慢病毒轉(zhuǎn)染方法構(gòu)建穩(wěn)定表達miR-184和對照miRNA（miR-NC）的U87細胞，再同時分別接種至裸鼠皮下和顱內(nèi)；定期動態(tài)測量裸鼠皮下包塊的最大長徑和寬徑；在磁共振T2圖像下觀察腫瘤變化情況并且在接種后的第35天處死裸鼠取出移植瘤稱重后石蠟包埋固定并制作成病理切片；免疫組織檢測TNFAIP2及Ki-67的表達情況。
　　結(jié)果：
　　1. MiR-184在5株膠

6、質(zhì)瘤細胞和49例膠質(zhì)瘤組織標本中表達下調(diào)
　　MiRNA芯片數(shù)據(jù)分析結(jié)果提示，miR-184在膠質(zhì)瘤細胞中表達下調(diào)；進一步運用qRT-PCR驗證發(fā)現(xiàn)miR-184在5株膠質(zhì)瘤細胞（U87、U251、U373、A172、SHG44）中的表達明顯低于非瘤腦組織（P<0.01）；miR-184在49例膠質(zhì)瘤組織標本中表達明顯低于8例非瘤腦組織標本（P<0.01），并隨著膠質(zhì)瘤惡性級別增加miR-184在膠質(zhì)瘤組織標本中表達量逐漸下調(diào)。<

7、br>　　2.過表達miR-184可抑制U87和U251細胞的增殖、細胞周期進展并誘導(dǎo)凋亡U87和U251細胞株分別轉(zhuǎn)染miR-184 mimics和對照miRNA（miR-NC），然后
　　通過CCK-8比色法在酶聯(lián)免疫檢測儀450nm波長下測量吸光度，聯(lián)連續(xù)監(jiān)測3天。與對照miR-NC組相比較miR-184可明顯抑制U87和U251細胞的增殖(P<0.01)；同時，流式細胞儀分析發(fā)現(xiàn)過表達miR-184可明顯增加U87和U25

8、1細胞中G0/G1期所在細胞周期中的比例，而處于S期的細胞則顯著下降（P<0.05）；與對照組相比較，過表達miR-184可誘導(dǎo)U87和U251細胞早期凋亡,下調(diào)miR-184的表達可減少細胞凋亡數(shù)。
　　3.過表達miR-184可抑制U87和U251細胞的侵襲和遷移
　　劃痕試驗結(jié)果顯示，與對照組相比較miR-184過表達組可抑制U87及U251細胞劃痕區(qū)的愈合；Transwell實驗提示miR-184過表達組U87和U2

9、51細胞的穿膜細胞數(shù)少于對照組。這一結(jié)果說明，miR-184可明顯抑制U251和U87的侵襲和遷移能力。
　　4.TNFAIP2在膠質(zhì)瘤組織和膠質(zhì)瘤細胞中表達上調(diào)
　　qRT-PCR結(jié)果提示TNFAIP2的mRNA在5株膠質(zhì)瘤細胞中的表達水平比在5例非瘤腦組織中的表達上調(diào)；在81例膠質(zhì)瘤組織標本中的表達比在非瘤腦組織中的表達上調(diào)；Western blot結(jié)果進一步發(fā)現(xiàn)TNFAIP2蛋白在5株膠質(zhì)瘤細胞中的表達均高于在正常人星

10、形細胞1800中的表達。因此，可推測在膠質(zhì)瘤中TNFAIP2和miR-184的表達負相關(guān)。
　　5. MiR-184在U87和U251中可負向調(diào)控TNFAIP2的表達
　　用miR-184 mimics、inhibitor和對照miRNA轉(zhuǎn)染U87和U251細胞，穩(wěn)定轉(zhuǎn)染后提取細胞總RNA和蛋白質(zhì)。qRT-PCR和Western blot結(jié)果均顯示過表達miR-184可顯著下調(diào)TNFAIP2蛋白的表達；下調(diào)miR-184可上

11、調(diào)TNFAIP2的表達。
　　6.MiR-184可抑制U87裸鼠體內(nèi)生長并抑制Ki-67和TNFAIP2的表達
　　與U87-miR-NC組相比較，U87-miR-184組裸鼠皮下腫瘤生長明顯受到抑制；U87-miR-184組腫瘤比U87-miR-NC組小，第35天時處死裸鼠并取出腫瘤測質(zhì)量，U87-miR-184組皮下腫瘤質(zhì)量為（0.27±0.10g）比U87-miR-NC組皮下腫瘤質(zhì)量（0.64±0.08g）小,差距有統(tǒng)

12、計學(xué)意義（P<0.01）；裸鼠顱內(nèi)腫瘤標本切片HE染色顯示與對照組相比，U87-miR-184組腫瘤體積明顯較小；免疫組化檢測發(fā)現(xiàn)miR-184明顯抑制了增殖指數(shù)Ki-67及靶基因TNFAIP2的表達。實驗證實miR-184可顯著抑制腦膠質(zhì)瘤細胞U87裸鼠體內(nèi)的生長，增殖。
　　結(jié)論：
　　1.發(fā)現(xiàn)miR-184在膠質(zhì)瘤組織標本和膠質(zhì)瘤細胞株中表達下調(diào)，TNFAIP2然而在膠質(zhì)瘤組織及細胞株中表達上調(diào)；
　　2.過表達