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文檔簡(jiǎn)介
1、前言:
膠質(zhì)瘤是最常見的原發(fā)性腦腫瘤,其中膠質(zhì)母細(xì)胞瘤是成人膠質(zhì)瘤中惡性程度最高的一種,患者平均生存時(shí)間為15個(gè)月[1]。除手術(shù)之外,術(shù)后的放療加化療是有效的治療方法,能明顯延長(zhǎng)一些患者的生存時(shí)間[2]。然而,各種類型的調(diào)節(jié)因子,如生長(zhǎng)因子、激素類因子等導(dǎo)致治療的失敗[3-4]。
胰島素樣生長(zhǎng)因子結(jié)合蛋白-2(Insulin-like growth factor binding protein-2,IGFBP-2)是
2、由各種組織通過復(fù)雜的調(diào)節(jié)過程產(chǎn)生的[5],先前研究已經(jīng)證實(shí)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤中IGFBP-2的表達(dá)水平明顯高于低級(jí)別的神經(jīng)膠質(zhì)瘤和正常腦組織,并通過IGF依賴性或非依賴性作用機(jī)制發(fā)揮其生物學(xué)特性[6-8]。膠質(zhì)母細(xì)胞瘤患者血清中IGFBP-2的水平明顯增高,并與患者的生存率呈負(fù)相關(guān)[9-10]。然而,血清中IGFBP-2對(duì)本病的進(jìn)展及預(yù)后影響的分子機(jī)制并不清楚。盡管IGFBP-2內(nèi)源性過表達(dá)與細(xì)胞的增殖和侵襲有關(guān),但這些結(jié)果一直是有爭(zhēng)議的[1
3、1-15]。并不能解釋血清中IGFBP-2的潛在作用,外源性IGFBP-2的作用需要進(jìn)一步被闡明。
IGFBP-2含有Arg-Gly-Asp(RGD)細(xì)胞粘附區(qū)域,并能潛在綁定在整合蛋白受體上,并進(jìn)一步激活細(xì)胞外信號(hào)調(diào)節(jié)激酶(ERKs)?,F(xiàn)已經(jīng)證實(shí)當(dāng)惡性腫瘤細(xì)胞受到外部刺激時(shí)整合蛋白-ERK通路激活并誘導(dǎo)細(xì)胞增殖和侵襲[16-18]。本研究旨在探討外源性IGFBP-2對(duì)不同級(jí)別膠質(zhì)瘤增殖和侵襲的影響,及相關(guān)的分子機(jī)制。同時(shí)探討
4、外源性IGFBP-2對(duì)膠質(zhì)瘤化療藥物替莫唑胺(Temozolomide,TMZ)耐藥性的影響。
材料和方法:
1、細(xì)胞培養(yǎng):
人膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系U87,U251和U373細(xì)胞購(gòu)自中國(guó)科學(xué)院上海細(xì)胞庫(kù)。人惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞系T98G從美國(guó)標(biāo)準(zhǔn)培養(yǎng)收集所獲得(ATCC,Rockville,MD,USA)。SU3膠質(zhì)瘤細(xì)胞由蘇州大學(xué)第二附屬醫(yī)院提供。細(xì)胞培養(yǎng)用含10%胎牛血清(fetal bovine ser
5、um,F(xiàn)BS;Invitrogen)的DMEM(Dulbecco's modifiedEagle's medium;Gibco)培養(yǎng)基。在37℃,5%CO2環(huán)境下培養(yǎng)。
2、IGFBP-2過表達(dá)結(jié)構(gòu)構(gòu)建
人IGFBP-2 cDNA克隆于pEGFP-N1質(zhì)粒(Clontech,Mountain View,CA,USA),合成pEGFP-N1-IGFBP-2質(zhì)粒和對(duì)照pEGFP-N1質(zhì)粒應(yīng)用陽(yáng)離子脂質(zhì)體(Lipofect
6、amine,Invitrogen)轉(zhuǎn)染至U87細(xì)胞,通過G418篩選出穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系,通過western-blot檢測(cè)IGFBP-2過表達(dá)的有效性。
3、RT-PCR
按TrizolTM試劑使用說明提取細(xì)胞總RNA,檢測(cè)其濃度,純度和完整性。按逆轉(zhuǎn)錄試劑盒使用說明操作,選用Oligo-dT做引物合成第一鏈cDNA,引物序列IGFBP-2 forward,5'-AGGTTGCAGACAATGGCGAT-3', IGFB
7、P-2 reverse,5'-GTAGAAGAGATGACACTCGG-3'; GAPDH forward,5'-GCACCGTCAA-GGCTGAGAAC-3',GAPDH reverse,5'-TGGTG AAGACGCCAGTGGA-3'。反應(yīng)條件為:94℃2分鐘;30×(94℃30秒,61℃30秒,72℃90秒);72℃10分鐘。
4、Western Blot法檢測(cè)蛋白
收集細(xì)胞加入裂解液充分裂解,低溫高速離
8、心(4℃,12000轉(zhuǎn)/min,30min),提取上清為總蛋白。上樣蛋白量為60ug。電泳(12%SDS-PAGE凝膠)、轉(zhuǎn)印(70V,120min)、5%正常小牛血清封閉,一抗4℃孵育過夜,分別與對(duì)應(yīng)的二抗室溫孵育2h,ECL顯色,結(jié)果經(jīng)自動(dòng)電泳凝膠成像分析儀(Chemi Imager5500,AlphaInnotech,USA)采集,進(jìn)行灰度值測(cè)定。
5、免疫熒光染色
接種細(xì)胞于24孔板中,多聚甲醛固定,用0.2
9、%的Triton-X100于常溫打孔15-30分鐘。1%的BSA常溫封閉30分鐘。封閉完后加入一抗,4℃過夜。次日,加入相應(yīng)二抗,室溫孵育1個(gè)小時(shí)后,Hoechst33342染核,熒光顯微鏡觀察。
6、MTT法檢測(cè)細(xì)胞增殖
將單個(gè)細(xì)胞懸液接種于96孔培養(yǎng)板中,每孔體積200ul含103個(gè)細(xì)胞,培養(yǎng)24h,每孔加入MTT溶液繼續(xù)培養(yǎng)4hr,吸去上清液,加入150ulDMSO(Sigma,USA),振蕩10min,490
10、nm波長(zhǎng)下測(cè)定各孔光吸收值,以不含細(xì)胞的等體積培養(yǎng)基作為對(duì)照。繪制細(xì)胞生長(zhǎng)曲線。
7、細(xì)胞計(jì)數(shù)
細(xì)胞種植在24孔板,每孔種植5×103個(gè)細(xì)胞,在DMEM+10%FBS培養(yǎng)液中培養(yǎng)24h,血清饑餓過夜,不同處理因素處理48h,PBS沖洗,胰酶消化成單細(xì)胞懸液,臺(tái)盼藍(lán)染色后進(jìn)行細(xì)胞計(jì)數(shù)。
8、流式細(xì)胞儀檢測(cè)細(xì)胞周期
收集對(duì)數(shù)生長(zhǎng)期細(xì)胞制成1×106個(gè)/ml細(xì)胞懸液。75%冷乙醇于4℃固定過夜、離心后制
11、成500μL的細(xì)胞懸液,加碘化丙啶染液于4℃避光孵育45分鐘后上機(jī)檢測(cè),ModFitLT3.0軟件分析細(xì)胞周期。
9、Transwell基質(zhì)膠細(xì)胞侵襲試驗(yàn)
用無(wú)血清的培養(yǎng)基將Matrigel加入到孔徑為8.0μm的Tranwell小室中,向小室的上室中加入100μl的細(xì)胞懸液(5×105cells/ml),下室中加入含10%FBS的血清作為趨化誘導(dǎo)劑,孵箱中孵育36小時(shí)后取出,用無(wú)菌的棉簽擦拭去上室的膠,濾膜經(jīng)固定、
12、染色后封片,鏡檢10個(gè)高倍視野(400×)。
結(jié)果:
1、內(nèi)源性IGFBP-2影響神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲
分別應(yīng)用RT-PCR和western-blot檢測(cè)了4種膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞和原發(fā)SU3膠質(zhì)瘤細(xì)胞中IGFBP-2的表達(dá)水平。根據(jù)表達(dá)水平在U87細(xì)胞中轉(zhuǎn)染p-EGFP-N1-IGFBP-2質(zhì)粒,并進(jìn)行western-blot檢測(cè),其IGFBP-2的表達(dá)水平明顯上調(diào)。MTT檢測(cè)發(fā)現(xiàn)U87細(xì)胞中過表達(dá)IGFBP
13、-2,細(xì)胞的增殖能力并沒有改變,侵襲實(shí)驗(yàn)發(fā)現(xiàn)高表達(dá)IGFBP-2的U87細(xì)胞其侵襲能力明顯增強(qiáng)(P<0.01)。
2、外源性IGFBP-2促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和侵襲
通過相差顯微鏡觀察到IGFBP-2處理后的細(xì)胞其生長(zhǎng)速度明顯加快。MTT分析得出外源性IGFBP-2誘導(dǎo)細(xì)胞增殖,并呈劑量依賴性。125ng/ml和250ng/ml的IGFBP-2處理細(xì)胞后,細(xì)胞的增殖率增加了33.8%-62.7%,500ng/m
14、l的IGFBP-2處理細(xì)胞,其增殖率增加了約1.4倍。在IGFBP-2處理細(xì)胞24h后應(yīng)用PI染色檢測(cè)了細(xì)胞周期,結(jié)果顯示IGFBP-2能促進(jìn)U87、U251、SU3細(xì)胞進(jìn)入S期和G2/M期,并呈劑量依賴性。125和250ng/ml的IGFBP-2能使G2/M期細(xì)胞比例由0-2.7%增加到8.1-17.4%,500ng/ml的IGFBP-2使G2/M期細(xì)胞比例達(dá)到30%。
應(yīng)用基質(zhì)膠侵襲分析檢測(cè)外源性IGFBP-2對(duì)U87、U
15、251和SU3細(xì)胞遷移的影響,IGFBP-2使膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲能力明顯增強(qiáng),并呈劑量依賴性。125和250ng/ml的IGFBP-2使細(xì)胞的侵襲能力增加了37.8-87.4%,500ng/ml的IGFBP-2使細(xì)胞的侵襲能力增加了近1倍。
3、外源性IGFBP-2通過ERK信-號(hào)通路促進(jìn)膠質(zhì)母細(xì)胞瘤細(xì)胞的增殖和侵襲
膠質(zhì)瘤細(xì)胞在500ng/mlIGFBP-2處理培養(yǎng)后,不同時(shí)間點(diǎn)提取蛋白應(yīng)用western-blot檢
16、測(cè)ERK的活性。盡管總ERK蛋白的表達(dá)水平?jīng)]有增加,但是IGFBP-2處理30min后,與對(duì)照組相比,磷酸化的ERK(p-ERK)蛋白表達(dá)水平明顯增高。免疫熒光檢測(cè)500ng/ml外源性IGFBP-2處理細(xì)胞30min后增強(qiáng)了ERK的磷酸化和核的轉(zhuǎn)入。在U87、SU3、U251細(xì)胞中加入ERK的阻斷劑PD9805后再加入外源性IGFBP-2培養(yǎng)細(xì)胞,檢測(cè)發(fā)現(xiàn)加入ERK阻斷劑后抑制了IGFBP-2誘導(dǎo)的細(xì)胞增殖和侵襲。
4、IG
17、FBP-2誘導(dǎo)對(duì)TMZ的耐藥性
應(yīng)用100μM的TMZ處理U87細(xì)胞后,細(xì)胞的增殖明顯受到抑制(抑制率64.2%),而在TMZ之前應(yīng)用500ng/ml的IGFBP-2處理細(xì)胞,TMZ對(duì)細(xì)胞增殖的抑制被IGFBP-2消除,應(yīng)用ERK的抑制劑PD98059或抗整聯(lián)蛋白β1中和抗體能對(duì)抗IGFBP-2的影響。應(yīng)用基質(zhì)膠侵襲實(shí)驗(yàn)檢測(cè)了TMZ對(duì)U87細(xì)胞侵襲的影響,TMZ處理細(xì)胞后明顯抑制了細(xì)胞的侵襲能力(抑制率44.7%)。而在TMZ
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