內(nèi)源性FOXP3抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞增殖遷移和侵襲.pdf

1、背景:轉(zhuǎn)錄因子FOXP3（Transcription factor forkhead box P3）是調(diào)節(jié)性T細(xì)胞（Regulatory T cells，Tregs）的特異性因子，在Tregs的發(fā)育和功能發(fā)揮中起重要作用。最近的研究發(fā)現(xiàn)FOXP3也在某些上皮細(xì)胞和腫瘤細(xì)胞中表達(dá)。本課題組前期的研究發(fā)現(xiàn)神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中存在FOXP3的表達(dá)，然而FOXP3在神經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的確切功能和分子機(jī)制仍不清楚。
　　目的：探討FOXP3對人神

2、經(jīng)膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、LN229增殖、凋亡、遷移和侵襲等生物學(xué)行為的影響，闡明FOXP3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞中的功能作用，進(jìn)一步加深對膠質(zhì)瘤發(fā)生發(fā)展的相關(guān)分子及分子基礎(chǔ)的理解。
　　方法：用脂質(zhì)體法將4個(gè)含有靶向FOXP3的shRNA序列（命名為shRNA1~4）和1個(gè)含有shRNA無意義陰性對照序列（Scrambled）的質(zhì)粒以及過表達(dá)FOXP3的質(zhì)粒（pCMV6-FOXP3-GFP）和其空載對照質(zhì)粒（pCMV6-Empty-GFP）轉(zhuǎn)

3、染入人膠質(zhì)瘤U87細(xì)胞和LN229細(xì)胞，并在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率；應(yīng)用Western blot法檢測轉(zhuǎn)染后FOXP3蛋白的表達(dá)情況，并篩選出最有效的一個(gè)shRNA干擾質(zhì)粒；應(yīng)用CCK-8法檢測轉(zhuǎn)染后U87細(xì)胞和LN229細(xì)胞增殖活性的變化；應(yīng)用流式細(xì)胞術(shù)（FCM）定量測定轉(zhuǎn)染后細(xì)胞的細(xì)胞周期和細(xì)胞凋亡的變化；應(yīng)用Western blot法分別檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspases-3和caspases-7的表達(dá)情況；轉(zhuǎn)染質(zhì)

4、粒后細(xì)胞的遷移和侵襲情況采用細(xì)胞遷移和侵襲實(shí)驗(yàn)方法進(jìn)行檢測。利用SPSS17.0軟件對實(shí)驗(yàn)數(shù)據(jù)進(jìn)行統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　結(jié)果：
　　1、轉(zhuǎn)染后的細(xì)胞表達(dá)熒光，放在倒置熒光顯微鏡下觀察轉(zhuǎn)染效率為80％，符合轉(zhuǎn)染的實(shí)驗(yàn)要求，細(xì)胞轉(zhuǎn)染72h后熒光表達(dá)效率最高，轉(zhuǎn)染效果最好。
　　2、Western blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染干擾質(zhì)粒后空白對照組(Control)、shRNA-1、shRNA-2、shRN

5、A-3、shRNA-4組和Scrambled組中FOXP3蛋白的表達(dá)受抑制最明顯的是shRNA-1組；轉(zhuǎn)染過表達(dá)質(zhì)粒后細(xì)胞FOXP3蛋白表達(dá)水平明顯上調(diào)（P<0.05）。
　　3、CCK-8結(jié)果顯示，下調(diào)FOXP3后U87細(xì)胞和LN229細(xì)胞增殖活性與對照組相比均顯著升高；上調(diào) FOXP3后細(xì)胞增殖活性與對照組相比則顯著降低（P<0.05）。
　　4、流式細(xì)胞術(shù)結(jié)果顯示，下調(diào)FOXP3后U87細(xì)胞和LN229細(xì)胞凋亡率與對照

6、組相比顯著降低；上調(diào)FOXP3后細(xì)胞凋亡率與對照組比較均顯著升高（P<0.05）。
　　5、Western blot法分別檢測轉(zhuǎn)染前后細(xì)胞凋亡相關(guān)蛋白caspases-3和 caspases-7表達(dá)情況結(jié)果顯示，上調(diào)FOXP3后細(xì)胞凋亡蛋白caspases-3和 caspases-7表達(dá)明顯升高，而下調(diào) FOXP3后 caspases-3和 caspases-7蛋白的表達(dá)則明顯降低（P<0.05）。
　　6、PI染色流式細(xì)胞

7、周期檢測分析顯示，上調(diào)FOXP3表達(dá)可以誘導(dǎo)U87、LN229細(xì)胞G0/G1期比例升高，S期比例降低，細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期；下調(diào)FOXP3細(xì)胞周期沒有顯著變化（P<0.05）。
　　7、Transwell小室細(xì)胞遷移、侵襲實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，下調(diào)FOXP3后U87細(xì)胞和LN229細(xì)胞遷移和侵襲能力與對照組相比顯著升高；上調(diào)FOXP3后細(xì)胞遷移和侵襲能力則顯著降低（P<0.05）。
　　結(jié)論：
　　1、轉(zhuǎn)錄因子FOXP3

8、在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株U87、LN229中具有抑制腫瘤細(xì)胞增殖的作用。
　　2、轉(zhuǎn)錄因子 FOXP3在膠質(zhì)瘤細(xì)胞株 U87、LN229中可能通過影響凋亡蛋白caspases-3和 caspases-7表達(dá)促進(jìn)腫瘤細(xì)胞凋亡。
　　3、上調(diào)膠質(zhì)瘤細(xì)胞FOXP3的表達(dá)可以誘導(dǎo)U87、LN229細(xì)胞發(fā)生細(xì)胞周期阻滯，使U87、LN229細(xì)胞周期阻滯在G0/G1期，可能成為膠質(zhì)瘤基因靶向治療的新策略。
　　4、FOXP3抑制U87細(xì)胞和