MicroRNAs let-7b-i通過IKBKE直接抑制人膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移.pdf

1、腦膠質(zhì)瘤是最常見和棘手的中樞神經(jīng)系統(tǒng)原發(fā)性腫瘤[1]，2/3以上為惡性膠質(zhì)瘤。即使采用現(xiàn)代綜合治療手段，惡性膠質(zhì)母細(xì)胞瘤的預(yù)后沒有得到明顯改善，病人的中位生存期為15-17個月[2][3]。腫瘤的高度侵襲性、神經(jīng)系統(tǒng)破壞能力和向周圍正常腦組織彌漫浸潤生長的特性是膠質(zhì)瘤復(fù)發(fā)的根本原因[4]。膠質(zhì)瘤的侵襲和迀移特性阻礙了膠質(zhì)瘤的傳統(tǒng)治療效果[5]。因此需要研究其發(fā)病機(jī)制，開拓新的治療途徑。然而，遺傳學(xué)研究的最新進(jìn)展正在探索與膠質(zhì)瘤發(fā)生、發(fā)展

2、相關(guān)的基因、信號通路及分子機(jī)制，基因療法已經(jīng)成為一種新的治療策略。
　　IKBKE亦稱為IKKε或IKK-i，是IKK家族成員[6,7]。在研究中發(fā)現(xiàn)IKBKE在乳腺癌[8,9]、卵巢癌[10]和前列腺癌[11]中激活并高表達(dá)。這些研究同樣顯示IKBKE可以促進(jìn)細(xì)胞的生存、生長并降低細(xì)胞對化療的敏感性[10,12,13]，并且IKBKE的高表達(dá)導(dǎo)致膠質(zhì)瘤細(xì)胞的惡性迀移[9,14]。我實驗室的前期研究表明IKBKE在人膠質(zhì)瘤細(xì)胞中高

3、表達(dá)，用siRNA抑制IKBKE的表達(dá)可以顯著抑制膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和增殖能力[15]。
　　近年的研究表明，人腦膠質(zhì)瘤呈現(xiàn)微小RNA的異常表達(dá)，其中包括let-7[16][17]。miRNA是一種長度約為22nt的非編碼單鏈小分子RNA，與靶基因3’非轉(zhuǎn)錄區(qū)域(3’UTR)特異性結(jié)合，使靶基因降解或抑制其翻譯，進(jìn)而對基因進(jìn)行轉(zhuǎn)錄后調(diào)控[18-24]。miRNA在細(xì)胞生長、分化、凋亡、增殖中發(fā)揮重要作用[25-27]。
　　L

4、et-7家族在功能和序列上高度保守。Let-7家族作為腫瘤抑制因子能夠抑制致癌基因和一些信號通路的關(guān)鍵基因，例如：HMGA2、MYC、RAS[28]研究表明，通過Ras途徑，let-7家族能夠降低GBM細(xì)胞的生長和迀移能力[16,29,30]。目前，一些數(shù)據(jù)間接表明膠質(zhì)瘤的不良預(yù)后和let-7低表達(dá)之間有關(guān)聯(lián)，但沒有數(shù)據(jù)顯示let-7在人膠質(zhì)瘤中低表達(dá)[31,32]。然而，生物信息學(xué)分析顯示，IKBKE是microRNAs let-7b

5、/i的靶基因。因此，let-7b/i可能是治療膠質(zhì)瘤的新靶點。故本課題研究miR-let-7b和miR-let-7i直接作用于IKBKE對膠質(zhì)瘤細(xì)胞系U251和 U87在迀移和侵襲方面的影響，探索并驗證可能存在的信號通路，為未來膠質(zhì)瘤的臨床治療提供實驗依據(jù)。
　　本課題研究分為以下兩個部分：
　　第一部分為let-7b/i在膠質(zhì)瘤中的表達(dá)及對IKBKE的靶向調(diào)控。應(yīng)用實時定量PCR(real time-PCR, RT-PCR

6、)的方法，我們檢測了3例正常腦組織和2個膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中l(wèi)et-7b/i的表達(dá)水平；采用Target Scan6.2、microRNA-Targets and Expression來尋找IKBKE的上游調(diào)控基因；應(yīng)用寡核苷酸let-7b/i mimics轉(zhuǎn)染2個膠質(zhì)瘤細(xì)胞系，并通過RT-PCR檢測let-7b/i的表達(dá)效果；應(yīng)用Western blot檢測轉(zhuǎn)染let-7b/i mimics后目標(biāo)基因的表達(dá)變化；應(yīng)用熒光素酶報告試驗驗證IK

7、BKE的上游調(diào)控基因。結(jié)果表明let-7b/i的表達(dá)在膠質(zhì)瘤中較正常組織顯著下降；Target Scan6.2分析顯示99個miRNAs和IKBKE存在直接相關(guān)性， microRNA-Targets and Expression分析顯示存在25個 miRNAs和IKBKE存在直接相關(guān)性。TargetScan6.2顯示let-7b、let-7i與基因IKBKE之間有更強(qiáng)的結(jié)合力，因此IKBKE可能為let-7b/i的靶基因。轉(zhuǎn)染let-7

8、b/i mimics后腫瘤細(xì)胞let-7b/i表達(dá)明顯升高，IKBKE表達(dá)量降低。熒光素酶實驗顯不與control組、scramble組及pZEX-IKBKE-3'UTR-Mut組比較，共轉(zhuǎn)染let-7b/i mimics和pZEX-IKBKE-3'UTR-wild質(zhì)粒時熒光強(qiáng)度顯著增高。故可推斷l(xiāng)et-7b/i直接靶向IKBKE。
　　第二部分為let-7b/i通過IKBKE/E-cadherin通路調(diào)控細(xì)胞的侵襲和遷移。采用劃

9、痕試驗、侵襲試驗檢測轉(zhuǎn)染let-7b/i mimics后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的迀移和侵襲能力；體外應(yīng)用RNA干涉技術(shù)以oligofectamine介導(dǎo)siRNA靶向IKBKE轉(zhuǎn)染人腦膠質(zhì)母細(xì)胞瘤U87和U251細(xì)胞后，應(yīng)用蛋白印跡檢測目的蛋白表達(dá)。結(jié)果顯示，轉(zhuǎn)染let-7b/i mimics后膠質(zhì)瘤細(xì)胞的侵襲和遷移能力下降；應(yīng)用RNA干涉技術(shù)以oligofectamine介導(dǎo)轉(zhuǎn)染靶向 IKBKE siRNA后，IKBKE表達(dá)下調(diào)，E-cadher

10、in表達(dá)升高，與第一部分的實驗研究發(fā)現(xiàn)轉(zhuǎn)染let-7b/i mimics后腫瘤細(xì)胞IKBKE表達(dá)下降，E-cadherin表達(dá)升高相一致。這些數(shù)據(jù)表明let-7b/i很可能通過IKBKE/E-cadherin通路調(diào)控細(xì)胞的侵襲和遷移。
　　結(jié)論：let-7b/i在膠質(zhì)瘤細(xì)胞系中低表達(dá)，通過生物信息學(xué)分析，蛋白免疫印跡檢測和熒光素酶實驗，我們證實let-7b/i為IKBKE的上游調(diào)控基因。通過體外實驗的研究，我們發(fā)現(xiàn)let-7b/i