圍產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育現(xiàn)狀及小兒腦癱ATG5和ATG7基因多態(tài)性的研究.pdf

1、背景：神經(jīng)系統(tǒng)的發(fā)育是通過受基因調(diào)控的神經(jīng)發(fā)生、細(xì)胞分化及遷徙等多個復(fù)雜過程而實現(xiàn)的并受母孕期環(huán)境因素的影響，相關(guān)基因的功能異常或者母親孕期高危因素的存在可導(dǎo)致胎兒神經(jīng)系統(tǒng)發(fā)育異常，包括胎兒或者新生兒神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)或者結(jié)構(gòu)的異常，如腦積水、神經(jīng)管畸形等，以及出生后需要進(jìn)一步的生化或者功能檢查才能確定是否存在功能發(fā)育異常，如智力障礙、腦癱等，這些神經(jīng)系統(tǒng)結(jié)構(gòu)以及功能發(fā)育異常是最嚴(yán)重的先天性出生缺陷，目前的預(yù)防和治療手段遠(yuǎn)未達(dá)到臨床實際需求。

2、我國每年約2000萬新生兒出生，其中先天發(fā)育異常兒有60萬左右。在發(fā)育異常的新生兒中，神經(jīng)管缺陷是較為常見的形態(tài)和結(jié)構(gòu)異常，我國每年有2億元用于這些患兒的救治。功能異常的神經(jīng)發(fā)育不良患兒數(shù)量遠(yuǎn)高于神經(jīng)系統(tǒng)形態(tài)和結(jié)構(gòu)的發(fā)育異常，由于不易早期識別，潛在危害以及經(jīng)濟(jì)負(fù)擔(dān)更加嚴(yán)重。自吞噬在腦的正常發(fā)育過程中起重要的作用，大量的新生細(xì)胞因未建立起功能連接而以自吞噬或者凋亡的方式被清除，以保持大腦的形態(tài)結(jié)構(gòu)正常發(fā)育。自吞噬在損傷因素的作用下被廣泛激

3、活，以清除大量壞死細(xì)胞，減少炎癥反應(yīng)，但是過度的自吞噬可以導(dǎo)致胞漿及細(xì)胞器的結(jié)構(gòu)和功能破壞，導(dǎo)致細(xì)胞死亡，因此自吞噬具有維持細(xì)胞存活和導(dǎo)致細(xì)胞死亡的雙重作用。自噬相關(guān)基因5和自噬相關(guān)基因7(ATG5和ATG7)是參與自噬體形成的重要成員，可能進(jìn)一步影響相關(guān)基因的功能表達(dá)，但是有關(guān)于ATG5和ATG7基因的多態(tài)性與腦性癱瘓的關(guān)系尚未見報道。腦癱是目前導(dǎo)致我國兒童致殘的首位原因，全國現(xiàn)有200萬以上腦癱患兒需要康復(fù)治療，其中有31萬例學(xué)齡前

4、腦癱患兒，并以每年4.6萬的速度遞增，嚴(yán)重影響了我國人口素質(zhì)的提高。但是腦癱的發(fā)病病因及發(fā)病機制目前尚不明確，越來越多的證據(jù)顯示遺傳因素在腦癱的發(fā)生發(fā)展過程中起重要作用。本研究首先通過臨床患兒的流行病學(xué)研究調(diào)查圍產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育現(xiàn)況的動態(tài)變化以及影響的因素，而后以導(dǎo)致兒童傷殘首位原因的腦癱為研究對象進(jìn)行臨床大樣本的實驗分析，探討自噬相關(guān)基因在腦癱患兒發(fā)生發(fā)展中的作用，為圍產(chǎn)兒神經(jīng)發(fā)育異常和腦癱的防治提供理論基礎(chǔ)。本研究分為四個部分：

5、　　第一部分：先天發(fā)育異常流行病學(xué)資料分析。
　　目的：通過整理收集河南省監(jiān)測醫(yī)院及監(jiān)測點內(nèi)住院分娩的所有妊娠滿28周至產(chǎn)后7天內(nèi)圍生兒中的先天發(fā)育異常兒，尤其是神經(jīng)管缺陷的發(fā)生情況，進(jìn)一步分析常見先天發(fā)育異常的發(fā)生率、分布地區(qū)和人群分布等，制定相應(yīng)的預(yù)防措施提供依據(jù)。
　　方法：本實驗的數(shù)據(jù)包括河南省從1997年1月1日到2011年12月31日所有監(jiān)測醫(yī)院及監(jiān)測點內(nèi)先天發(fā)育異常兒的信息，均經(jīng)體格檢查和其他輔助檢查如超聲、X

6、射線、核磁共振、染色體分析或尸檢等來證實診斷，確診后填寫《出生缺陷登記卡》，內(nèi)容包括孕齡、性別、母親年齡、居住地、主要診斷及新生兒轉(zhuǎn)歸等。所有信息輸入Excel2010表格，轉(zhuǎn)錄入SPSS17.0軟件進(jìn)行統(tǒng)計分析，發(fā)生率（％）采用卡方檢驗，發(fā)生率的趨勢采用邏輯回歸分析，以P＜0.05為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的檢驗水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：⑴15年間，我省檢測點共收集1815920名新生兒，有15660名圍產(chǎn)兒存在先天發(fā)育異常，平均發(fā)生率為86.

7、24/萬。監(jiān)測期間農(nóng)村平均發(fā)生率高于城市(χ2=4.023，P=0.045)。Logistic回歸分析顯示，農(nóng)村發(fā)生率呈顯著下降趨勢(P<0.0001)，城市發(fā)生率呈增長趨勢，且有統(tǒng)計學(xué)意義(P=0.003)?？偟钠骄l(fā)生率呈穩(wěn)步下降狀態(tài)，從1997年的109.8/萬到2003年的82.3/萬(χ2=49.06，P<0.001)，然后保持相對穩(wěn)定到2011年80.19/萬(χ2=185.29，P<0.0001)。15年間農(nóng)村發(fā)生率下降5

8、5.2%，城市發(fā)生率上升19.3%。導(dǎo)致整體發(fā)生率下降26.9%。⑵亞組分析顯示：男孩平均發(fā)生率為86.43/萬和女孩為83.54/萬(χ2=4.44，P=0.035)，男孩略高于女孩。所有監(jiān)測的人群中，母孕期不同年齡組中，平均發(fā)生率最低的78.2/萬為25到29歲間的組別，最高的為小于20歲組別，發(fā)生率為122.003（χ2=37.545；15年間，2007年以前神經(jīng)管缺陷的排名一直位居第一位，2009年以后位居第三位。其1997年發(fā)

9、生率為39.3/萬，到2011年下降到6.1/萬(χ2=388.853，P<0.001)，下降率達(dá)到84.5％。
　　結(jié)論：①15年間，我省先天發(fā)育異常發(fā)生率呈穩(wěn)步下降狀態(tài)。農(nóng)村顯著下降，城市呈增長趨勢。②男性發(fā)生率略高于女性。平均發(fā)生率最低母孕期年齡為25到29歲間，最高為小于20歲組別。③神經(jīng)管缺陷發(fā)生率呈明顯下降趨勢。
　　第二部分：圍產(chǎn)兒不良神經(jīng)預(yù)后的分析。
　　目的：采用圍產(chǎn)期出生新生兒及住院患兒資料統(tǒng)計分析

10、，并對診斷為新生兒腦損傷的患兒通過隨訪，研究分析其遠(yuǎn)期不良神經(jīng)預(yù)后。選擇從2007年1月至2012年12月由我院接診分娩和分娩后住院圍產(chǎn)兒為研究對象。所有數(shù)據(jù)分層按性別、出生體重、分娩方式、產(chǎn)婦年齡、孕齡，單胎或多胎，妊娠期并發(fā)癥（妊娠期糖尿病，妊高癥，胎膜早破等）等進(jìn)行記錄。所有圍產(chǎn)期新生兒及患兒發(fā)病率均以年為計算單位，對腦損傷患兒在其年齡≥1歲后進(jìn)行隨訪（住院病例+電話隨訪+來院復(fù)診）工作。所有數(shù)據(jù)應(yīng)用SPSS17.0統(tǒng)計軟件進(jìn)行分

11、析。計數(shù)資料以百分率(％)表示，采用χ2檢驗比較，多因素采用Logistic回歸分析，統(tǒng)計OR值及95%可信區(qū)間，均以P＜0.05差異有統(tǒng)計學(xué)意義的檢驗水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：⑴6年間我院分娩新生兒中，早產(chǎn)比例從21.4%下降到20.4%（P=0.27)，剖宮產(chǎn)發(fā)生率從65.2%下降到62.9%（P=0.029)。1695名住院新生兒被診斷為腦損傷，腦損傷發(fā)病率從17.4%增加到35.1%（P<0.001)，腦損傷后遺癥的發(fā)生率2.3%

12、上升到3.97%（P=0.443)。⑵新生兒入住NICU高危因素：出生體重風(fēng)險最大為1000～1499g(OR=3.185，95%CI2.258-4.491，P<0.001)，性別(OR=0.854，95%CI0.778-0.937，P<0.001)，1分鐘Apgar評分風(fēng)險最大為4～7分(OR=4.211，95%CI3.277-5.412，P<0.001)等；腦損傷高危因素：胎齡風(fēng)險最大為34～36+6 W(OR=1.55，95%CI

13、1.341-1.792，P＜0.001)，1分鐘Apgar評分風(fēng)險最大的為＜4分，不同分娩方式中剖宮產(chǎn)風(fēng)險最大(OR=1.499，95%CI1.102-2.038，P=0.01)，單胎或多胎(OR=2.051，95%CI1.821-2.312，P<0.001)等。⑶住院新生兒中，呼吸系統(tǒng)疾病占34.6%，比例最高，順位第二位的是黃疸，占25.9%，神經(jīng)系統(tǒng)疾病順位第四位占14.8%。⑷腦損傷影像學(xué)結(jié)果分正常，輕度異常，嚴(yán)重異常三組，發(fā)現(xiàn)

14、：結(jié)局中腦癱(χ2=13.871，P=0.001)，和智力缺陷(χ2=6.332，P=0.042)，統(tǒng)計上有差異。⑸不同胎齡段分早期早產(chǎn)兒，晚期早產(chǎn)兒和足月兒三組。三組住院發(fā)病率、腦損傷發(fā)生率、腦損傷后遺癥發(fā)生率比較，(χ2分別為8551.7，17.28，22.16，P均<0.001)。
　　結(jié)論：①剖宮產(chǎn)發(fā)生率呈下降趨勢。新生兒腦損傷的發(fā)生率趨于上升現(xiàn)象。②新生兒入住NICU和是否發(fā)生腦損傷的危險因素不完全相同。③不同影像學(xué)結(jié)果

15、及不同胎齡腦損傷及后遺癥發(fā)生率不同。
　　第三部分：ATG5和ATG7基因多態(tài)性與小兒腦癱的關(guān)聯(lián)性研究。
　　目的：采用大樣本病例-對照研究，通過分析腦癱患兒 ATG5和ATG7的基因多態(tài)性，在中國漢族人群中探討自噬相關(guān)基因和腦癱易感性之間的關(guān)系。
　　方法：選擇715例腦癱患兒為實驗組，同期隨機選擇658例體檢兒童為對照組，兩組年齡等基本信息比較均沒有統(tǒng)計學(xué)差異。分別選擇ATG5的5個SNP位點（rs573775，r

16、s510432，rs6568431，rs2299863和rs3804338）；ATG7的6個SNP位點（rs11706903，rs2606750，rs346078，rs4684787，rs1470612和rs2594972），使用Massarray分型技術(shù)對兩組進(jìn)行基因分型。使用SHEsis在線軟件進(jìn)行基因數(shù)據(jù)分析，每個 SNP的多重檢驗均使用SNPSpD在線系統(tǒng)進(jìn)行校正。以P<0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的檢驗水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：

17、⑴ATG5基因的rs6568431位點的基因型及等位基因型頻率在腦癱組和正常對照組間比較有統(tǒng)計學(xué)差異，P值分別為0.0005和0.0015；ATG7基因的rs14706126和rs2594972兩個 SNP位點的基因型及等位基因型頻率在腦癱組和正常對照組間比較有差異，P值分別為0.02、0.0004和0.044、0.0012。⑵性別分析：ATG5基因的rs6568431位點等位基因頻率和基因型頻率在男性腦癱組與男性對照組間存在顯著差異（

18、P=0.005和0.004）；ATG7基因的rs1470612和rs2594972位點等位基因及基因型頻率在男性腦癱組和男性對照組比較存在統(tǒng)計學(xué)差異（P=0.02，0.0004，0.044和0.0012）；⑶新生兒期并發(fā)癥分析：ATG5基因rs6568431位點等位基因頻率和基因型頻率腦癱伴HIE組與對照組間比較存在顯著差異（P<0.0001和P=0.0005）；ATG7基因rs2594972位點等位基因頻率在腦癱伴PVL組與對照組間比

19、較存在差異（P=0.016）；同樣rs2594972位點的等位基因頻率和基因型頻率在腦癱伴HIE組與對照組間比較存在顯著差異（P均＜0.0001），伴或不伴HIE的腦癱患兒在位點rs2594972的等位基因頻率和基因型頻率比較存在顯著差異（P均＜0.0001）；⑷腦癱類型分析：ATG7基因的rs1470612，rs2594972位點在痙攣型腦癱和對照組間比較等位基因頻率和基因型頻率均存在統(tǒng)計學(xué)差異，除rs1470612基因型頻率外，存在

20、統(tǒng)計學(xué)差異（P均＜0.05）。另外，rs11706903、rs4684787、rs1470612和rs2594972位點的等位基因和基因型頻率在痙攣型雙癱組與對照組之間除rs4684787處的基因型頻率外都有統(tǒng)計學(xué)差異（P均＜0.05）；⑸母孕期并發(fā)癥分析：ATG5基因腦癱患兒母孕期是否存在胎膜早破與對照間比較，rs573775位點等位基因頻率和基因型頻率分布存在差異（P=0.015和0.04）；ATG7基因腦癱患兒母孕期是否存在胎膜早

21、破與對照組比較，rs1470612和rs2594972位點等位基因頻率和基因型頻率分布存在顯著差異（P均＜0.05）；⑹腦癱伴有合并癥分析：ATG5基因的腦癱患兒伴有智力低下組和不伴有智力低下組分別與對照組比較，rs6568431位點的等位基因頻率和基因型頻率分布均存在顯著差異（P=0.015和0.02）；⑺其它亞組分組與對照組間沒有差異（P＞0.05）。
　　結(jié)論：①ATG5和ATG7基因多態(tài)性與腦癱的易感性相關(guān)；②ATG5和A

22、TG7基因多態(tài)性與腦癱患兒性別相關(guān)，ATG5基因與腦癱患兒伴有PROM和智力低下相關(guān)，ATG7基因與腦癱患兒伴HIE和痙攣型雙癱有關(guān)。
　　第四部分：腦癱患兒ATG7啟動子熒光素酶基因活性的測定。
　　目的：采用克隆ATG7基因啟動子的方法，插入螢光素酶報告基因載體，檢測不同組別熒光素酶表達(dá)量的差異，探討其于小兒腦癱的可能關(guān)系。
　　方法：采用細(xì)胞質(zhì)粒轉(zhuǎn)染和luciferase檢測技術(shù)，在工具細(xì)胞293T細(xì)胞（人胚胎腎

23、細(xì)胞）中擴(kuò)增ATG7啟動子，插入熒光素酶報告基因載體pGL3-empty CON080，將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞，選取不同的SNP位點野生型和突變型，測定其啟動子的轉(zhuǎn)錄活性（ATG7的rs1470612和rs2594972位點），并與SV40病毒轉(zhuǎn)化的啟動子活性進(jìn)行比較。使用SPSS17.0進(jìn)行統(tǒng)計學(xué)分析，單因素分析，計量資料以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差表示，采用t檢驗進(jìn)行比較，以P＜0.05作為差異有統(tǒng)計學(xué)意義的檢驗水準(zhǔn)。
　　結(jié)果：⑴構(gòu)建

24、了ATG7基因不同位點啟動子的熒光素酶報告基因；通過測序及質(zhì)粒酶切鑒定，所構(gòu)建的ATG7基因的啟動子正確；⑵活性測定表明，報告基因在重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染293T細(xì)胞SV40病毒轉(zhuǎn)染后及不同基因位點中顯示構(gòu)建ATG7基因不同啟動子活性，并呈現(xiàn)一定的劑量效應(yīng)；⑶ATG7基因的rs1470612和rs2594972位點的熒光素酶檢測比較，突變型luciferase相對表達(dá)量均降低，野生型和突變型間存在差異（P<0.0001和P=0.009）。