衰老相關ATG5缺陷致中性粒細胞胞外陷阱形成障礙.pdf

1、研究背景:
　　中性粒細胞是固有免疫系統(tǒng)的前沿防線。除經(jīng)典的趨化、調(diào)理、吞噬和清除作用外，中性粒細胞還存在著另一套極為重要的限制和殺滅病原體的方法，即中性粒細胞胞外陷阱NETs。NETs是一種復雜的三維網(wǎng)狀DNA結(jié)構(gòu)，其上附著有多種具有殺傷病原體功能的組分。盡管對NETs形成機制、關鍵環(huán)節(jié)的研究有了很多突破，但對于還有哪些理化生物因素能夠誘導NETs，以及關鍵的機制、分子是否存在共性，仍沒有一個確切的答案。老年人群的疾病發(fā)生率和死

2、亡率均遠高于年輕人群，以感染相關疾病的情況最為突出，這與免疫衰老密切相關，即衰老對免疫系統(tǒng)功能功能的影響。中性粒細胞作為固有免疫的重要組成部分，衰老使其趨化能力受損、對細菌的清除能力減弱、炎癥因子表達和抗凋亡活性改變。但其對NETs形成的影響證據(jù)不足、機制不清。如若衰老影響了中性粒細胞NETs形成和NETosis過程，那么是否還會影響另一種死亡形式，凋亡？衰老導致中性粒細胞NETosis與凋亡的改變，其中的關鍵環(huán)節(jié)是什么？本研究將著力解

3、決上述三個問題。
　　第一部分 TLR2配體誘導ROS和自噬依賴的NETs形成
　　目的:
　　中性粒細胞作為固有免疫系統(tǒng)的組分之一，其NETosis的過程及產(chǎn)物NETs，在機體抵抗病原體感染的過程中發(fā)揮著重要的作用。已經(jīng)明確多種物質(zhì)均可誘導中性粒細胞產(chǎn)生NETs，對于機體感染/抗感染、炎癥反應/抗炎反應過程中的其他分子，能否刺激中性粒細胞產(chǎn)生NETs仍不清楚。本部分研究假設一:Toll樣受體2(TLR2)配體能夠有效

4、誘導NETs形成。假設二:TLR2配體誘導的NETs形成為活性氧產(chǎn)物ROS依賴的。假設三:自噬過程同樣參與了TLR2配體誘導的NETs形成。
　　方法:
　　實驗一:為明確TLR2配體能否誘導NETs形成，提取的野生型WT小鼠原代腹腔中性粒細胞，體外經(jīng)肽聚糖PGN刺激6h后，confocal下觀察NETs形成。同時選擇具有代表性的其他TLR2配體:LM、LTA、Pam3CSK4、Pam2CSK4、zymosan，confoc

5、al觀察驗證體外誘導NETs形成的能力。進一步以6種TLR2配體刺激中性粒細胞2、3、6h，采用熒光定量法檢測NETs形成的強弱。實驗二:為明確TLR2和MyD88在上述配體誘導NETs形成中的作用，采用TLR2 knock-out(KO)小鼠和MyD88 KO小鼠的中性粒細胞，體外給予PGN刺激6h，經(jīng)confocal觀察NETs形成。進一步采用熒光定量法分析上述6種配體體外誘導的WT、TLR2 KO和MyD88 KO小鼠中性粒細胞N

6、ETs形成是否存在差異。實驗三:為明確TLR2配體與TLR4配體在誘導NETs上是否存在協(xié)同效應，采用極小劑量的LPS或PGN體外刺激中性粒細胞6h后經(jīng)confocal觀察。為進一步驗證，采用熒光定量法進行檢測。實驗四:為明確NADPH氧化酶依賴的ROS產(chǎn)生是否為TLR2誘導的NETs形成所必需，采用gp91 KO小鼠進行實驗。首先用流式細胞術(shù)檢測gp91 KO和WT小鼠中性粒細胞胞內(nèi)ROS的基礎和PGN刺激后水平。進而使用定量檢測分析

7、比較gp91 KO和WT小鼠中性粒細胞TLR2配體誘導的NETs形成。進一步經(jīng)Confocal觀察TLR2配體刺激的gp91 KO小鼠中性粒細胞。實驗五:為明確自噬過程是否參與TLR2配體誘導的NETs形成，同時給予雷帕霉素和PGN6 h同單獨給予PGN后經(jīng)confocal觀察NETs形成。
　　結(jié)果:
　　實驗一:與對照相比，PGN能夠誘導典型的NETs結(jié)構(gòu)。同時，選擇的另外5種TLR2配體也均能夠刺激中性粒細胞形成NET

8、s。相比于對照組，6種配體均可顯著提高培養(yǎng)上清液的熒光強度，提示NETs的形成增加。實驗二:經(jīng)confocal觀察，PGN不能顯著誘導TLR2 KO和MyD88 KO小鼠中性粒細胞的NETs形成。定量分析TLR2 KO和MyD88 KO小鼠中性粒細胞的NETs形成均低于WT型小鼠。實驗三:極小劑量LPS和PGN均不能顯著誘導NETs形成，而兩者聯(lián)合應用則可以明顯增加NETs形成。定量分析得到類似的結(jié)果。實驗四:gp91KO小鼠中性粒細胞

9、胞內(nèi)ROS的基礎與WT小鼠無差異，在PGN刺激后則低于WT小鼠。多種TLR2配體刺激誘導的NETs形成均低于WT小鼠中性粒細胞。Confocal觀察處理6h后也均未見顯著的NETs形成。實驗五:confocal觀察并計數(shù)結(jié)果表明PGN加入雷帕霉素相比于單獨使用PGN，進一步提高了NETs的生成。
　　結(jié)論:
　　多種TLR2配體可以有效誘導NETs形成;TLR2-MyD88通路為該過程所必需;TLR2配體和TLR4配體在誘導

10、NETs形成上具有協(xié)同效應;NADPH氧化酶產(chǎn)生的ROS為TLR2配體誘導的NETs形成所必需;且自噬也參與該過程。
　　第二部分老年小鼠中性粒細胞NETs形成障礙及其機制
　　目的:
　　免疫衰老，即衰老引起的免疫系統(tǒng)功能減退，影響著固有免疫和適應性免疫應答的方方面面。中性粒細胞功能的改變直接影響著老年個體對病原體的防御能力。衰老使得中性粒細胞趨化能力受損、對病原體的吞噬及清除能力降低、ROS的產(chǎn)生受到影響、抗凋亡能

11、力發(fā)生改變、信號轉(zhuǎn)導異常等。但對于老年個體NETs形成的影響證據(jù)較少，機制不清。本部分研究假設一:老年小鼠中性粒細胞NETs形成存在障礙，弱于年輕小鼠。假設二:老年和年輕小鼠中性粒細胞自噬活性的差異是NETs形成障礙的原因。假設三:ATG5是老年小鼠中性粒細胞TLR信號誘導的自噬活性缺陷的關鍵分子。假設四:老年小鼠中性粒細胞NETs形成障礙還存在其他機制，如趨化能力減弱，ROS產(chǎn)生減少。
　　方法:
　　實驗一:為明確老年和

12、年輕小鼠中性粒細胞體內(nèi)NETs形成能力是否存在差異，取年輕和老年小鼠構(gòu)建盲腸結(jié)扎穿刺CLP模型，獲取6h后腹腔灌洗液，采用confocal觀察其中NETs形成的情況。進一步采用熒光定量法分析兩種小鼠CLP后腹腔灌洗液中的NETs含量。實驗二:為明確老年和年輕小鼠趨化能力差異對NETs形成的影響，采用流式細胞術(shù)檢測CLP模型6h后腹腔募集的中性粒細胞比例。為排除衰老后骨髓中性粒細胞生成能力對募集到腹腔的中性粒細胞比例的影響，采用流式細胞術(shù)

13、檢測老年和年輕小鼠骨髓中性粒細胞的比例。實驗三:提取老年小鼠腹腔中性粒細胞，在體外用第一部分研究所述6種TLR2配體刺激6h后經(jīng)confocal觀察。進一步采用熒光定量法對比年輕和老年小鼠NETs形成能力的差異。為明確除TLR2配體外其他刺激下老年小鼠中性粒細胞NETs形成是否也存在障礙，體外給予LPS刺激6h后經(jīng)confocal觀察并一步用定量分析證實。實驗四:為明確中性粒細胞表面TLR2數(shù)量是否影響老年小鼠NETs形成，采用流式細胞

14、術(shù)檢測PGN刺激前后老年和年輕小鼠中性粒細胞膜表面TLR2數(shù)量。進一步檢測TLR2配體誘導的ROS產(chǎn)生是否有差異。實驗五:為明確年輕和老年小鼠中性粒細胞在TLR2配體刺激后自噬活性是否存在差異，采用Western blot檢測基礎水平和PGN刺激2、4、6h后中性粒細胞中LC3B的蛋白表達。為進一步證實低自噬活性參與了老年小鼠中性粒細胞NETs形成障礙，體外PGN刺激的同時，給予雷帕霉素以提高自噬活性，驗證其能否改善老年組NETs形成。

15、實驗六:分析公開發(fā)表的高通量轉(zhuǎn)錄組基因數(shù)據(jù)，尋找老年組和年輕組間自噬相關的差異表達基因。進一步采用western blot驗證差異基因的蛋白表達水平。
　　結(jié)果:
　　實驗一:老年小鼠CLP6 h后腹腔灌洗液中NETs形成明顯少于年輕小鼠。定量分析的結(jié)果類似。實驗二:老年小鼠CLP6 h后腹腔灌洗液中CD11b+Ly6G+細胞群比例低于年輕小鼠。而老年和年輕小鼠骨髓中性粒細胞群的比例無差異。實驗三:老年中性粒細胞在TLR2配

16、體刺激下均不能有效形成NETs，熒光定量分析表明老年組NETs形成明顯低于年輕組。相比于年輕小鼠，LPS刺激的老年組NETs形成也存在障礙，定量分析得到類似結(jié)果。實驗四:老年和年輕小鼠中性粒細胞膜表面TLR2數(shù)量在靜息狀態(tài)下和PGN刺激后無明顯差異。而6種TLR2配體體外刺激老年小鼠中性粒細胞3h誘導的胞內(nèi)ROS產(chǎn)量均低于年輕小鼠。實驗五:年輕和老年小鼠的LC3B表達在PGN刺激后逐漸升高，在所有時間點，老年組的蛋白表達水平均低于年輕組

17、。體外同時給予PGN和雷帕霉素，老年小鼠中性粒細胞的NETs形成能力得到了一定程度的恢復。實驗六:高通量數(shù)據(jù)分析發(fā)現(xiàn)ULK1、ATG13和ATG5的轉(zhuǎn)錄表達存在差異。Western blot結(jié)果表明各個時間點老年組ATG5的蛋白表達水平均低于相應的年輕組，而ULK1、ATG13的表達差異不明顯，此外，老年組mTOR的表達水平略高于年輕組。
　　結(jié)論:
　　在體和體外多種TLR配體的刺激下，老年小鼠中性粒細胞NETs形成弱于年

18、輕小鼠。刺激后自噬活性低可能是原因之一。ATG5是老年小鼠中性粒細胞TLR信號誘導自噬活性缺陷的關鍵分子。還可能存在別的影響老年小鼠NETs形成的因素，包括趨化能力、ROS產(chǎn)量和mTOR活性。
　　第三部分老年小鼠中性粒細胞自噬缺陷致凋亡活性改變
　　目的:
　　正常情況下，靜息狀況的中性粒細胞會發(fā)生自發(fā)性凋亡;而活化的中性粒細胞除凋亡外還可以走向NETosis。老年小鼠中性粒細胞的NETs形成能力減弱，那么細胞凋亡水

19、平在老年個體上是否也發(fā)生改變？是否受同一細胞過程的調(diào)控？本部分研究假設一:在TLR2配體刺激下，老年小鼠中性粒細胞更傾向于凋亡。假設二:老年和年輕小鼠在凋亡和NETosis水平上的差異均受自噬活性的調(diào)控。
　　方法:
　　實驗一:為明確老年和年輕小鼠在TLR2配體刺激下凋亡活性是否存在差異，將老年和年輕小鼠的腹腔中性粒細胞體外給予PGN刺激6、12h，采用流式細胞術(shù)分析細胞凋亡比例。實驗二:為明確TLR2信號誘導的中性粒細胞

20、凋亡是否受自噬調(diào)控，年輕小鼠中性粒細胞體外PGN刺激的同時，給予自噬抑制劑wortmannin或balfilomycin A1，觀察凋亡比例的變化。在老年細胞上重復該實驗。進一步在年輕和老年小鼠中性粒上給予PGN和自噬增強劑，觀察凋亡變化。實驗三:在年輕小鼠細胞上應用PGN和自噬抑制劑，經(jīng)confocal同時觀察凋亡和NETosis水平，檢驗自噬同時調(diào)控凋亡和NETosis的假說。
　　結(jié)果:
　　實驗一:靜息6h和PGN刺

21、激6/12 h后，老年組的中性粒細胞凋亡比例均高于年輕組。實驗二:同時給予PGN和wortmannin或balfilomycin A1相比于單純給予PGN進一步提高了凋亡細胞的比例，老年細胞的結(jié)果類似。而自噬增強劑能夠減少凋亡比例。實驗三:給予PGN和兩種自噬抑制劑后，細胞NETosis減少，凋亡明顯增加。
　　結(jié)論:
　　老年小鼠中性粒細胞在TLR2配體刺激下更傾向于凋亡，而非NETosis。中性粒細胞的自噬過程同時調(diào)控了