豬鏈球菌2型誘導(dǎo)中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)形成和逃避殺菌效應(yīng)及其機制的初步研究.pdf

1、豬鏈球菌是一種對養(yǎng)豬業(yè)危害十分嚴(yán)重的細菌。豬感染后的臨床癥狀主要表現(xiàn)為關(guān)節(jié)炎、腦膜炎、肺炎和敗血癥等，豬鏈球菌亦可感染人并導(dǎo)致發(fā)病及死亡。1998年在江蘇省和2005年在四川省爆發(fā)了人感染豬鏈球菌2型(SS2)的病例引起了較嚴(yán)重的臨床癥狀及高病死率。進一步說明SS2是一種重要的人獸共患傳染病病原，并導(dǎo)致了嚴(yán)重的公共衛(wèi)生危害。
　　中性粒細胞是細菌感染早期激活的免疫細胞，在控制豬鏈球菌感染過程中起著十分重要的作用。中性粒細胞的殺菌方

2、式主要有吞噬、脫顆粒和胞外誘捕網(wǎng)。其中，中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)(Neutrophil extracellular traps，NETs)是指中性粒細胞在某些病原感染或者特殊物質(zhì)刺激的條件下會釋放自身細胞核內(nèi)的大量DNA到周圍組織來捕獲病原，并利用其所含有的殺菌物質(zhì)發(fā)揮其殺菌效應(yīng)，是一種新型的天然免疫機制已被廣泛接受。
　　前期的研究表明豬鏈球菌高毒力菌株可有效抵御中性粒細胞吞噬殺菌和脫顆粒殺菌作用。但關(guān)于NETs在豬鏈球菌感染中的作

3、用及機制還缺乏研究。因此，研究NETs在豬鏈球菌感染中的作用和機制對于揭示豬鏈球菌的致病機制有重要意義。本研究分別從體內(nèi)、體外水平開展了中性粒細胞胞外誘捕網(wǎng)在豬鏈球菌2型感染中作用的研究。并進一步利用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)方法及相應(yīng)的信號通路抑制劑分析了豬鏈球菌2型誘導(dǎo)中性粒細胞形成胞外誘捕網(wǎng)的主要信號通路。
　　首先，為了分析NETs在SS2感染時是否發(fā)揮作用，本研究通過熒光顯微鏡觀察發(fā)現(xiàn)，SS2感染小鼠后，其感染部位可以形成典型

4、的NETs結(jié)構(gòu)，說明SS2感染時可以誘導(dǎo)NETs形成。之后，通過注射核酸酶破壞NETs結(jié)構(gòu)的方法評價了NETs在SS2感染中的作用。結(jié)果表明，使用核酸酶破壞NETs結(jié)構(gòu)后，感染小鼠血液中的載菌量和前炎癥因子TNF-α水平顯著升高，小鼠的臨床癥狀更加明顯，致死率顯著升高。表明NETs在小鼠感染SS2后細菌的清除以及炎癥因子水平控制上發(fā)揮重要作用。
　　盡管NETs在抵抗SS2感染中發(fā)揮重要作用，然而SS2仍可感染小鼠并導(dǎo)致其死亡，這

5、就說明SS2可能存在逃避NETs殺菌效應(yīng)的機制。為了解釋這一現(xiàn)象，本研究利用體外實驗解析了SS2逃避NETs殺菌作用的機制。研究發(fā)現(xiàn)不同毒力SS2菌株均可以誘導(dǎo)小鼠中性粒細胞形成NETs。進一步比較NETs對這些SS2菌株的殺傷作用表明，不同毒力的SS2菌株均可以有效地逃避NETs殺菌，而缺失莢膜多糖(Capsular polysaccharides，CPS)的SS2菌株卻可以被NETs有效地殺傷，說明SS2可以通過其CPS結(jié)構(gòu)逃避NE

6、Ts的殺菌效應(yīng)。通過熒光共聚焦顯微鏡分析NETs對細菌的捕獲發(fā)現(xiàn)，不同毒力的SS2菌株均可以逃避NETs的捕獲，而莢膜多糖基因缺失突變體可以明顯被其捕獲.說明SS2的CPS結(jié)構(gòu)有助于SS2逃避NETs捕獲，并進而逃避NETs的殺菌效應(yīng)。
　　由于NETs形成的機制尚不十分清楚，因此為了進一步分析SS2誘導(dǎo)NETs形成的分子機制，本研究采用非標(biāo)記定量蛋白質(zhì)組學(xué)的方法分別分析了SS2高致病性菌株05ZY誘導(dǎo)小鼠中性粒細胞形成NETs的

7、差異蛋白表達譜，并以PMA(Phorbol-12-myristate-13-acetate)刺激形成NETs作為陽性對照。結(jié)果顯示，PMA組與05ZY組細胞差異表達蛋白有75％是相符的。這些蛋白主要參與了核苷酸結(jié)合、核糖核酸結(jié)合、ATP結(jié)合等生命活動。分別對PMA刺激組和05ZY感染組參與NETs形成的信號通路進行分析，發(fā)現(xiàn)05ZY感染后激活NETs形成的信號通路與PMA刺激組基本一致。其中，MPO活性、活性氧(Reactive oxy

8、gen species，ROS)產(chǎn)生、PKC(Protein kinase C)均參與了PMA或05ZY誘導(dǎo)形成NETs的過程。生物進程分析表明有大量參與肌動蛋白骨架重排的蛋白質(zhì)表達發(fā)生變化。為研究肌動蛋白在NETs形成過程中的作用，本研究使用肌動蛋白聚合的抑制劑細胞松弛素B來探討肌動蛋白聚合對NETs形成的作用。結(jié)果表明，細胞松弛素B處理后，PMA誘導(dǎo)的NETs水平顯著降低，但對SS2誘導(dǎo)的NETs水平無明顯影響，但具體機制尚不明確。