豬鏈球菌血清2型分子診斷技術研究及初步應用.pdf

1、豬鏈球菌病是一種嚴重危害養(yǎng)豬業(yè)的重要傳染病，可引起豬的腦膜炎、關節(jié)炎、敗血癥、心內膜炎和中毒休克綜合征等，給養(yǎng)殖業(yè)造成很大的經濟損失。豬鏈球菌是世界范圍內引起豬鏈球菌病的最主要的病原，根據莢膜多糖可將豬鏈球菌分為35個血清型，即血清1～34型和血清1/2型。其中血清1型、2型、7型和9型對豬的致病性較強，尤其是豬鏈球菌血清2型，不僅對豬致死性強，而且能引起人的發(fā)病和死亡，在公共衛(wèi)生方面引起了極大的關注。本研究旨在建立針對豬鏈球菌的快速特

2、異的分子生物學和免疫學檢測方法，同時對河南省境內豬群中的豬鏈球菌感染情況進行調查，為該病的病原分子生物學研究、快速診斷和有效防制提供參考。
　　 1.豬鏈球菌血清2型河南分離株的主要毒力基因鑒定及其cps2J全基因序列分析
　　 為了解SS2河南分離株的毒力基因型及cps2J全基因突變情況，本研究設計并合成了7對擴增SS2毒力基因gdh、cps2J、mrp、ef、sly、orf2和fbps的特異性引物，建立檢測SS2的7

3、種毒力基因的PCR方法，并對SS2的cps2J進行全基因序列測定和同源性分析。結果表明，gdh，cps2J、mrp、ef、sly、orf2和fbps基因在8個SS2分離株中的檢出率分別為100％(8/8)、100％(8/8)、62.5％(5/8)、75％(6/8)、87.5(7/8)、100％(8/8)和100％(8/8)；其中cps2J全基因核苷酸及推導的氨基酸序列與來源不同的SS2分離株同源性分別達98％和97％以上，以該基因構建的

4、系統發(fā)育樹表明8株SS2河南分離株與國內外不同參考株同源性高，親緣關系密切。
　　 2.豬鏈球菌血清2型cps2H基因的表達及抗原性分析
　　 為研究SS2莢膜多糖cps2H重組蛋白的抗原性，利用PCR技術擴增ZMDSC-2(SS2)株的cps2H全基因，將擴增產物與pMD18-T克隆載體連接，重組質粒經PCR、酶切鑒定后進行測序；將構建的pET32a(+)-cps2H原核表達載體轉化至大腸桿菌BL21中，經IPTG誘導

5、表達，表達產物進行SDS-PAGE和Western-blouing分析后，將純化的cps2H重組蛋白免疫小鼠，用ELISA檢測其血清抗體。結果顯示：cps2H全基因為1371bp，表達的重組蛋白大小為66.2KDa，最佳的誘導條件為1.0mmol/L的IPTG誘導3h，重組蛋白與SS2陽性血清的免疫印記分析呈陽性反應；小鼠免疫第7天后血清中即可檢測到抗cps2H重組蛋白的特異性抗體，并于免疫后第28天達到高峰。上述結果表明：cps2H重

6、組蛋白具有良好的抗原性，可作為SS2的疫苗候選分子和免疫診斷抗原。
　　 3.豬鏈球菌血清2型環(huán)介導等溫擴增快速檢測方法的建立與應用
　　 為了建立快速、靈敏的SS2LAMP檢測方法，根據GenBank登錄的SS2特異的莢膜多糖(cps2H)基因序列作為檢測靶標，在其序列的保守區(qū)域設計LAMP引物，利用參考菌株S735(SS2)基因組DNA為模板進行擴增，優(yōu)化了LAMP的反應條件和反應體系，并進行了敏感性、特異性和重復性

7、試驗。結果表明：利用建立的LAMP方法對SS2進行擴增，擴增產物顯色呈現陽性反應，電泳出現階梯狀條帶，最低檢測量為0.186fg/μL模板DNA，比常規(guī)PCR高1000倍；且與其他常見的細菌無交叉反應，臨床樣品的檢測結果表明，建立的LAMP方法優(yōu)于普通PCR方法。說明本研究建立的LAMP方法具有靈敏、特異、快速和重復性強等優(yōu)點，適用于本病的實驗室快速檢測。
　　 4.豬鏈球菌種及1、2、7、9型多重PCR方法的建立及應用

8、　　 根據SS谷氨酸脫氫酶(gdh)基因序列和SS1(14)、SS2(1/2)、SS7、SS9的型特異cps1I、cps2H、cps7H、cps9G基因序列，分別設計一對種特異性引物和4對型特異性引物，通過優(yōu)化反應條件，建立了鑒定SS及SS1(14)、SS2(1/2)、SS7、SS9的多重PCR檢測方法，該方法的特異性和敏感性均良好。應用建立的多重PCR方法對臨床上的61份無臨床癥狀豬扁桃體進行了檢測。結果顯示，61份豬扁桃體SS檢出

9、率為77.0％(47/61)，其中SS2占14.8％(9/61)，SS7占4.9％(3/61)，SS9占32.8％(20/61)，無SS1存在。該方法可作為SS快速診斷和分子流行病學研究的重要手段。
　　 5.豬鏈球菌血清2型抗體IHA檢測方法的建立及應用
　　 為了建立適用臨床上檢測SS2抗體的IHA檢測方法，用SS2的莢膜多糖(capsularpolys-accharide，CPS)致敏經戊二醛處理過的雞紅細胞，優(yōu)化

10、致敏醛化紅細胞的抗原量和時間。在37℃條件下CPS(2.25μg/mL)致敏雞紅細胞90分鐘，IHA試驗在25℃條件下操作，被檢血清IHA效價在1:8及其以上時判為SS2抗體陽性。應用此方法對豬大腸桿菌、副豬嗜血桿菌、豬腸球菌、SS1、SS7、SS9、金黃色葡萄球菌、沙門氏菌、巴氏桿菌陽性血清進行檢測，結果SS2抗體均為陰性。對1044份無臨床癥狀的豬血清進行檢測，SS2抗體陽性率為61.69％。該方法敏感性高，特異性較強，可用于大規(guī)模