豬鏈球菌2型多重耐藥膜相關(guān)蛋白篩選.pdf

1、豬鏈球菌2型現(xiàn)有的耐藥機制多局限于研究某一機制的個別基因及蛋白,難以解釋細菌多重耐藥產(chǎn)生的全部現(xiàn)象,更不能全面揭示細菌多重耐藥的分子基礎(chǔ)及機制。為此,我們擬采用人工誘導(dǎo)的方法,在實驗室誘導(dǎo)出豬鏈球菌2型多重耐藥菌株,在此基礎(chǔ)上,運用蛋白組學(xué)技術(shù),尋找耐藥相關(guān)的蛋白,并通過實時熒光定量PCR的方法對實驗結(jié)果進行驗證。由此來探究豬鏈球菌在多重耐藥產(chǎn)生過程中獲得耐藥性的主要方式及其共存的耐藥機制。具體研究內(nèi)容如下:
　　 1豬鏈球菌多

2、重耐藥菌株的誘導(dǎo)
　　 本文采用微量稀釋法測定了臨床分離的38株豬鏈球菌對6種抗菌藥物的最小抑菌濃度(MIC)；將其中3株同時對紅霉素、環(huán)丙沙星敏感的菌株采用體外遞增藥物濃度的方法分別誘導(dǎo)其對紅霉素、環(huán)丙沙星同時耐藥,測定親本株與誘導(dǎo)株的MIC,并用外排泵抑制劑利血平聯(lián)合用藥探究其對豬鏈球菌耐藥株耐藥性的影響；采用PCR和基因測序的方法分析了誘導(dǎo)菌株的ermB、ermA、ermC、mefA、msrD、mphB、tetM、tetO

3、、tetL、tetK、核糖體23S rRNA、核糖體蛋白L4、L22及DNA回旋酶(gyrA和gyrB)和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ(parC和parE)耐藥決定區(qū)(QRDR)的基因突變和氨基酸序列變化。結(jié)果表明:臨床分離的豬鏈球菌對紅霉素、環(huán)丙沙星的耐藥率分別達39.5％(15/38)、28.9％(11/38),對磺胺間甲氧嘧啶及四環(huán)素均耐藥,對氨芐西林、氟苯尼考均敏感；用紅霉素和環(huán)丙沙星采用濃度遞增法成功誘導(dǎo)了豬鏈球菌對紅霉素及環(huán)丙沙星耐藥；環(huán)丙

4、沙星與利血平聯(lián)合用藥時,其MIC值顯著降低,但紅霉素與利血平聯(lián)合用藥時,MIC值基本沒有變化；PCR及測序結(jié)果顯示誘導(dǎo)的多藥耐藥菌株無外源耐藥基因ermB、ermA、ermC、mefA,msrD、mphB,但檢測到tetM和tetO及氟喹諾酮靶位DNA回旋酶(gyrA和gyrB)和拓撲異構(gòu)酶Ⅳ(parC和parE)耐藥決定區(qū)(QRDR)的突變。
　　 2豬鏈球菌敏感株與誘導(dǎo)耐藥株雙向凝膠電泳試驗
　　 為了分離豬鏈球菌臨

5、床敏感株和誘導(dǎo)耐藥株的差異蛋白質(zhì),篩選與豬鏈球菌產(chǎn)生多重耐藥相關(guān)的蛋白質(zhì)分子,進一步揭示豬鏈球菌產(chǎn)生耐藥性的相關(guān)耐藥機制,本實驗通過Triton X-114法分別提取兩種細菌的膜相關(guān)蛋白,進行等電點聚焦和SDS-聚丙烯胺凝膠電泳,對所得膠圖利用ImageMaster5.0軟件進行分析。在此基礎(chǔ)上,選取差異點進行質(zhì)譜分析,對分析結(jié)果進行數(shù)據(jù)庫檢索。通過實驗得到了分辨率較好的雙向凝膠電泳圖譜,在敏感株與耐藥株膜蛋白圖譜中分別檢出(311±5

6、3)和(237±53)個蛋白質(zhì)斑點,初對其中的9個差異蛋白質(zhì)斑點切取并進行了MALDI-TOF-MS分析。將原始質(zhì)譜文件輸入并查尋NCBI數(shù)據(jù)庫,搜索后均匹配得到與豬鏈球菌相關(guān)的蛋白質(zhì)點,每個蛋白質(zhì)點有一到多個蛋白群組成.由此發(fā)現(xiàn),在豬鏈球菌臨床敏感株和誘導(dǎo)耐藥株之間存在差異表達蛋白,通過對雙向凝膠電泳有關(guān)條件進行優(yōu)化,可將這些蛋白質(zhì)斑點有效分離,己鑒定的蛋白質(zhì)與細菌的新陳代謝、毒力、耐藥性等有關(guān),可為進一步研究豬鏈球菌多重耐藥機制提供

7、線索。
　　 3實時熒光定量RT-PCR檢測耐藥相關(guān)差異蛋白的mRNA表達水平
　　 為了進一步研究蛋白質(zhì)組學(xué)實驗中發(fā)現(xiàn)的多藥耐藥相關(guān)ABC轉(zhuǎn)運蛋白在細菌耐藥性產(chǎn)生過程中的作用,本文通過熒光定量PCR的方法測定了環(huán)丙沙星敏感豬鏈球菌菌株JR05730及其誘導(dǎo)的環(huán)丙沙星中介菌株JR05730-M和耐藥菌株JR05730-EC中該轉(zhuǎn)運蛋白對應(yīng)基因SS2069mRNA的表達情況.結(jié)果表明:隨著細菌耐藥性的加強,中介菌和耐藥菌S