溶酶體膜蛋白-2抗體促發(fā)中性粒細胞胞外捕網(wǎng)形成在ANCA相關性血管炎中的分子機制.pdf

1、背景與目的:
　　ANCA(anti-neutrophilcytoplasmicantibody,抗中性粒細胞胞漿抗體)相關性血管炎(ANCA-associatedvasculitis,AAV)是以中性粒細胞異常死亡,導致血管發(fā)生壞死性炎癥的自身免疫疾病。腎臟最常受累,表現(xiàn)為PiCGN(pauci-immunecrescenticglomerulonephritis,寡免疫復合物新月體腎炎),病情進展兇險,可導致迅速進展、不可逆轉(zhuǎn)

2、的腎功能衰竭。
　　ANCA不僅作為AAV診斷及活動性監(jiān)測的標志,而且可作用于中性粒細胞,導致中性粒細胞異常活化及凋亡延遲,在AAV發(fā)病中起關鍵作用。LAMP-2(lysosomalmembraneprotein-2,溶酶體膜蛋白-2)抗體是最近才發(fā)現(xiàn)的ANCA新亞型,比傳統(tǒng)ANCA具有更高的敏感性和與腎臟損害的相關性。但LAMP-2抗體的致病機理依然不清。NETs(neutrophilextracellulartraps,中性粒

3、細胞胞外捕網(wǎng))是以釋放染色質(zhì)纖維及大量殺菌酶為特征的中性粒細胞新的死亡方式,直接與炎癥及自身免疫相關。
　　本研究擬檢測LAMP-2抗體陽性AAV患者外周血及腎組織中是否存在大量NETs形成的組分,并在體外探討LAMP-2抗體促發(fā)中性粒細胞異常死亡的可能機制,為LAMP-2抗體促發(fā)NETs形成參與AAV發(fā)病提供依據(jù)。
　　方法:
　　1.臨床上收集5名LAMP-2抗體陽性AAV患者外周靜脈血及腎活檢標本,采用Polym

4、orphprepTM密度梯度離心法分離患者及健康志愿者外周靜脈血中性粒細胞,FITC-CD16抗體標記,流式分析鑒定其純度,免疫熒光標記NETs及自身抗原LAMP-2、PR3、MPO的表達,了解AAV患者外周血及腎臟是否出現(xiàn)NETs形成。
　　2.分離健康人外周靜脈血中性粒細胞,體外LAMP-2抗體刺激中性粒細胞,通過AnnexinV–AlexaFluor488凋亡試劑盒及流式細胞術檢測中性粒細胞凋亡狀態(tài),透射電鏡檢測自噬小體,W

5、esternblot檢測自噬相關蛋白Beclin-1的表達及LC3Ⅰ向LC3Ⅱ的轉(zhuǎn)換,掃描電鏡及免疫熒光觀察NETs形成;活細胞成像觀察LAMP-2抗體促發(fā)NETs形成,并進一步通過特異性阻斷劑Z-vad-fmk、Nec-1、3MA及DPI分別阻斷凋亡、壞死、自噬及活性氧簇的產(chǎn)生,體外探討LAMP-2抗體促中性粒細胞異常死亡的可能機制。
　　結(jié)果:
　　1.通過CD16抗體標記及FACS分析,獲得了純度大于95％的中性粒細胞

6、,DAPI標記鑒定呈現(xiàn)為中性粒細胞特有的分葉核結(jié)構。
　　2.AAV患者外周血中NETs形成數(shù)量明顯高于健康志愿者(P=0.0014)。
　　3.AAV患者腎小球及間質(zhì)內(nèi)有大量DNA、組蛋白及ANCA靶抗原LAMP-2、PR3、MPO組成的NETs組分沉積。
　　4.LAMP-2抗體處理中性粒細胞24h后,凋亡率較對照組明顯降低(P<0.0001)。
　　5.LAMP-2抗體作用中性粒細胞30min時胞漿內(nèi)出現(xiàn)大

7、量未成熟的自噬小體,Beclin-1的表達較對照組明顯升高(P=0.0150),LC3Ⅰ顯著向LC3Ⅱ轉(zhuǎn)換(P=0.0258)。
　　6.LAMP-2抗體體外刺激中性粒細胞180min后較同型對照組,有大量NETs形成(P<0.0001)及靶抗原MPO、PR3、LAMP-2釋放。
　　7.以Z-vad-fmk和Nec-1分別阻斷凋亡和壞死,LAMP-2抗體促發(fā)的NETs形成無明顯變化,3MA阻斷自噬后NETs形成明顯減少(P

8、=0.0103),DPI抑制NADPH氧化酶的活性后NETs形成被阻斷(P<0.0001)。
　　結(jié)論:
　　本研究發(fā)現(xiàn)LAMP-2抗體陽性AAV患者外周血及腎組織中存在大量NETs形成;體外證實LAMP-2抗體阻礙了中性粒細胞凋亡,促發(fā)了自噬及NETs形成,從而導致DNA及ANCA靶抗原的釋放,且這一特殊死亡過程依賴于自噬及活性氧簇的產(chǎn)生。提示LAMP-抗體可能通過NETs形成暴露內(nèi)源性危險信號,啟動自身免疫反應,維持血管