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文檔簡介
1、背景與目的:
抗中性粒細胞胞漿抗體(antineutrophil cytoplasmic autoantibody, ANCA)相關(guān)性血管炎(ANCA-associated vasculitis, AAV)是一種自身免疫性炎癥性小血管炎,在我國并不少見,尤其是在老年人中,隨著ANCA檢測的普及,發(fā)病率有逐年上升。該病臨床表現(xiàn)復雜常伴多器官受累,腎臟是最常累及的器官,其病情進展兇險,可導致迅速不可逆的腎功能衰竭。迫切需要更進一步
2、地研究 AAV的發(fā)病機制,以便提出更有效的治療策略。
正五聚素-3(Pentraxin3, PTX3)是與C-反應蛋白(C-reactive protein,CRP)同為正五聚素蛋白家族的急性期反應蛋白,是體內(nèi)一種可溶性模式識別受體(Pattern recognition receptors, PRR),已被證實參與了許多自身免疫性疾病,并與疾病的活動性及局部組織炎癥相關(guān)。中性粒細胞胞外捕網(wǎng)(Neutrophil extrac
3、ellular traps,NETs)是中性粒細胞一種新發(fā)現(xiàn)的獨特的死亡方式,通過釋放出自身 DNA及大量自身抗原及相關(guān)顆粒酶。NETs成分中可能含有PTX3,共同參與炎癥及自身免疫。新近研究提示, PTX3可中和外來病原體,以一種天然抗體的形式保護機體。
ANCA作為一種特異性生物學標志,不僅用于 AAV的診斷,也與疾病活動性相關(guān),同時ANCA本身也具有致病性,直接參與疾病的進展,形成AAV自身免疫性炎癥的惡性循環(huán)。我們前期
4、研究發(fā)現(xiàn):ANCA可誘導中性粒細胞NETs形成釋放自身DNA及ANCA抗原,暴露內(nèi)源性危險信號。AAV患者體內(nèi)血清及局部腎組織高表達PTX3,并與CRP,ESR相比,可能更能迅速反映局部組織的炎癥狀態(tài)及損傷,有望成為新的急性期反應蛋白,更能及時反映疾病的活動性。
本課題擬通過:
(1)檢測AAV患者血清PTX3水平及腎組織PTX3的表達,結(jié)合臨床病例進行BVAS評分,分析血清PTX3表達與臨床血清學指標及尿蛋白的關(guān)系
5、,以探討PTX3在AAV發(fā)病中的意義。
(2)體外分離純化健康人及AAV患者外周血中性粒細胞,ANCA誘導健康人中性粒細胞并探測PTX3的表達,探討PTX3在中性粒細胞的釋放機制,為進一步研究PTX3在AVV發(fā)病中的作用奠定基礎(chǔ)。
方法:
第一部分AAV患者腎組織及血清正五聚素-3的表達及意義
1.免疫熒光染色及激光共聚焦法檢測活動期 AAV患者腎組織活檢標本中 PTX3的表達,了解活動期患者局部
6、腎臟炎癥部位是否存在豐富的PTX3。
2.臨床上收集 AAV患者和健康人外周靜脈血標本,采用 ELISA方法檢測血清PTX3及CRP水平,了解患者體內(nèi)PTX3及CRP水平與健康對照組的差異;
3.回顧性分析患者臨床病歷資料,用 BVAS評分,評估活動期及緩解期 AAV患者。獨立樣本非配對 t檢驗,兩獨立樣本非參數(shù)的曼-惠特尼 U檢驗,皮爾遜相關(guān)性分析,評價活動期與緩解期患者PTX3表達與腎功能損害的關(guān)系;受試者工作特
7、征性曲線評價PTX3及CRP區(qū)分疾病活動期、緩解期的準確度;
第二部分 ANCA誘導中性粒細胞正五聚素-3的釋放機制
1.采用PolymorphprepTM密度梯度離心法,分離患者及健康志愿者外周靜脈血中性粒細胞,用CD16抗體標記,流式細胞術(shù)進行分析,鑒定純度;臺盤藍染色法分別計算各組細胞平均存活率;
2.ELISA方法檢測各組中性粒細胞培養(yǎng)上清PTX3水平
3.正常中性粒細胞細胞靜止狀態(tài)下,以
8、及LAMP-2抗體刺激組、TNF-α刺激組、AAV患者血清刺激組及健康人血清刺激組刺激180min后,免疫熒光染色觀察中性粒細胞的PTX3的釋放情況。
結(jié)果:
第一部分
1.活動期AAV患者(n=3)腎局部炎癥組織中高表達PTX3,而系膜增生及IgA腎病患者腎組織僅有少量PTX3表達。
2.活動期 AAV患者(n=21)血清 PTX3水平比緩解期患者(n=11)明顯升高(P<0.0001),也顯著
9、高于健康對照組(n=38)(P=0.03)和SLE組(P<0.01)。而SLE患者(n=8)血清PTX3水平卻降低,且與健康對照組相比具有顯著性差異(P<0.001)
3.活動期AAV患者血清CRP和ESR水平均顯著高于緩解期(P<0.05)。而低PTX3水平的SLE患者組與健康對照組相比,CRP和ESR水平均升高(P>0.05)。
4. AAV患者的PTX3水平與24h尿蛋白定量呈正相關(guān)(r=0.4329,P=0.
10、0169);與白細胞計數(shù),中性粒細胞絕對值,淋巴細胞絕對值,補體C3,血肌酐及eGFR均無明顯相關(guān)性(r=0.0819,-0.1486,0.2474,0.0691,-0.1495,0.1790,均P>0.05)。血清CRP,ESR水平均與24h尿蛋白定量無明顯相關(guān)性(r=-0.0993,P=0.5887;r=0.1262,P=0.4912);PTX3與CRP水平均與BVAS呈正相關(guān)(r=0.3807,P=0.0316;r=0.3712,
11、 P=0.0365),而ESR卻與BVAS無相關(guān)性(r=0.2926,P=0.1041)。
5. ROC曲線提示血清PTX3水平區(qū)分活動期與緩解期AAV的準確度高于CRP及ESR; PTX3曲線下面積為0.9567,P<0.0001;CRP曲線下面積為0.7792,P=0.0105;ESR曲線下面積為0.7424,P=0.0263。以0.721 ng/mL作為區(qū)分截取值時,敏感度和特異度分別是90.48%和100%。
12、 第二部分
6.免疫熒光顯示PTX3儲存在正常靜止狀態(tài)的中性粒細胞中,AAV患者外周血中性粒細胞(n=3)釋放大量PTX3,較健康對照組(n=9)明顯升高(P=0.0402)
7.LAMP-2抗體及AAV患者血清均能刺激中性粒細胞中PTX3的釋放。LAMP-2抗體刺激組上清PTX3水平與正常中性粒細胞對照組相比,明顯升高(P=0.0020);與健康人血清刺激對照組相比,AAV患者血清刺激組上清PTX3的平均熒光強度(
13、MFI)明顯升高(P=0.0029)。
8.激光共聚焦顯微鏡顯示:PTX3隨自身抗原MPO及DNA一起,由中性粒細胞通過NETs方式釋放出胞外。
結(jié)論:
1.活動期 AAV患者腎臟局部組織存在PTX3高表達,且血清PTX3水平明顯升高,其水平與疾病活動性及24h尿蛋白總量呈正相關(guān),可能成為一種新的 AAV活動性的急性反應蛋白。
2. AAV患者中性粒細胞釋放出大量PTX3,正常中性粒細胞可由ANC
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