新城疫病毒P基因編碼蛋白拮抗Ⅰ型干擾素信號通路的機制研究.pdf

1、新城疫(Newcastle Disease，ND)是由新城疫病毒(Newcastle Disease Virus，NDV)強毒株引起的烈性、高度接觸性傳染病，在世界范圍內流行，感染多種禽類，給養(yǎng)禽業(yè)造成巨大經濟損失。NDV基因組結構為3'-NP-P-M-F-HN-L-5'，其中P基因能通過“RNA編輯”產生結構蛋白P及非結構蛋白V和W，P/V/W蛋白具有相同的氨基端和不同的羧基端。NDV V蛋白被認為是毒力因子之一，與其IFN通路拮抗能

2、力有關，也與NDV溶瘤特性相關。
　　目前關于NDVV蛋白拮抗IFN信號具體機制的研究尚不多見，有研究表明V蛋白能通過降解STAT1(Signal transducer and activator of transcription1，STAT1)發(fā)揮阻斷IFN信號的作用。然而另一研究結果發(fā)現(xiàn)，在NDV感染細胞及V蛋白過表達細胞系中，STAT1蛋白能與V蛋白共存，暗示存在其他的IFN信號阻斷機制。為了進一步研究V蛋白拮抗IFN信號的

3、具體機制，本文通過多種NDV毒株感染多種細胞，以及NDV真核表達質粒轉染等技術手段，檢測IFN信號通路中關鍵蛋白的表達水平及磷酸化修飾水平，鑒定與之相關的病毒蛋白，闡明其作用機制。最終，利用V蛋白缺失株ZJ1-Vs對實驗結果進行驗證。本研究的結果為NDV P基因編碼蛋白P/V/W在拮抗Ⅰ型IFN信號通路中的功能提供了新的見解。
　　1.三種基因型NDVP/V/W真核表達質粒構建及多克隆抗體的制備
　　為獲得檢測V蛋白表達的抗

4、體，本研究通過擴增NDV9a5b毒株V蛋白PNT結構域和CTD結構域，以及ZJ1毒株V蛋白CTD結構域，連入原核表達載體pET-28a或pColdTF進行原核表達，蛋白純化后免疫小鼠，獲得9a5b V蛋白和ZJ1 VCD多克隆抗體。同時利用Overlapping PCR構建了9a5b、La Sota和ZJ1毒株V和W蛋白真核表達質粒。結果顯示，9a5b V蛋白多抗和ZJ1 VCD多抗反應性良好，可用于V蛋白表達檢測。9a5b、La So

5、ta和ZJ1毒株V和W蛋白真核表達質粒也構建成功并正確表達。NDV感染人源細胞系HeLa和禽源細胞系DF1后V蛋白表達存在宿主差異，易感宿主雞源DF1細胞中V蛋白表達量更高，而在哺乳動物細胞中，V蛋白并不能有效表達。
　　2.NDV V蛋白介導STAT1降解的毒株差異分析
　　為驗證NDV對IFN信號通路中關鍵蛋白STAT1的作用，本實驗使用9a5b、La Sota和ZJ1等NDV毒株感染和V蛋白真核表達質粒轉染HeLa和V

6、ero細胞。Western-blot檢測相關蛋白的表達水平，比較轉染、感染單一作用或共同作用下，細胞內STAT1的變化水平。結果發(fā)現(xiàn)，NDV感染HeLa和Vero細胞STAT1降解不明顯，轉染V蛋白后也得到同樣的結果。有趣的是，只有在轉染V蛋白后感染NDV，STAT1才出現(xiàn)明顯的降解，且不同毒株之間存在差異。該結果表明，V蛋白對STAT1的降解作用受到毒株差異、感染后細胞生物學活動變化或其他病毒蛋白的影響。
　　3.NDVP基因編

7、碼蛋白對STAT1磷酸化水平的影響及反向遺傳毒株驗證
　　根據(jù)上述實驗結果，我們推測V蛋白可能通過其他途徑間接地誘導STAT1蛋白的降解。眾所周知，STAT1蛋白磷酸化是IFN信號通路激活的重要環(huán)節(jié)。為驗證V蛋白是否與磷酸化STAT1(p-STAT1)相互作用，本研究通過外源IFN-α刺激，NDV感染及真核表達質粒轉染，泛素抑制劑處理，并最終通過反向遺傳V蛋白缺失株ZJ1-Vs驗證，NDV V蛋白通過針對性介導p-STAT1蛋白發(fā)