弓形蟲P24基因敲除質(zhì)粒的構(gòu)建及缺陷型蟲株建立方法的初步研究.pdf

1、研究目的： 建立弓形蟲P24基因缺陷型蟲株，并對(duì)缺陷型蟲株建立的條件進(jìn)行探索。 研究方法： (1)弓形蟲P24基因敲除轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGB/P5-P3的構(gòu)建根據(jù)TgP24基因序列，設(shè)計(jì)并合成兩對(duì)特異引物(P1 to P4)，采用PCR技術(shù)特異擴(kuò)增TgP24基因的5'端非翻譯區(qū)2.5 kb片段(P245'UTR)和3'端非翻譯區(qū)2.89 kb片段(P24 3'UTR)，將其分別亞克隆入pCR2.1-TOPO TA載體。構(gòu)

2、建質(zhì)粒P24 5'UTR/TA和P243'UTR/TA；重組質(zhì)粒P24 5'UTR/TA經(jīng)KpnⅠ和BglⅡ雙酶切后，再將純化的P24 5'UTR片段亞克隆入轉(zhuǎn)染質(zhì)粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ位點(diǎn)，構(gòu)建重組質(zhì)粒pGB-P5(GRA2/Ble-P24 5'UTR)；重組質(zhì)粒P24 3'UTR/TA經(jīng)BamHⅠ和NotⅠ雙酶切后，純化P24 3'UTR片段，再將其定向克隆到重組質(zhì)粒pGB-P5的BamHⅠ和NotⅠ位點(diǎn)。從而構(gòu)建T

3、gP24基因敲除轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGB/P5-P3。 (2)弓形蟲P24基因缺陷型蟲株篩選條件的建立采用微孔濾膜(孔徑為5.0um)過濾法純化弓形蟲速殖子；比較觀察電穿孔條件，如電轉(zhuǎn)染緩沖液，電壓，電容，脈沖次數(shù)對(duì)質(zhì)粒轉(zhuǎn)染蟲株的影響。體外比較觀察不同宿主細(xì)胞(HFF，3T3和L929)對(duì)轉(zhuǎn)染蟲株藥物篩選的影響;比較觀察單獨(dú)細(xì)胞內(nèi)藥物篩選和結(jié)合細(xì)胞外藥物低溫處理對(duì)蟲株篩選的影響(細(xì)胞中選擇培養(yǎng)10天左右，收集蟲體，4℃下福來霉素處理5天，

4、再回復(fù)到細(xì)胞內(nèi)用選擇培養(yǎng)基培養(yǎng)約7天)。 (3)弓形蟲P24基因缺陷型蟲株的建立及鑒定分析應(yīng)用優(yōu)化條件的電穿孔方法轉(zhuǎn)染RH株速殖子，以已建立的最佳篩選條件對(duì)蟲株進(jìn)行篩選，將蟲株繼續(xù)在細(xì)胞中傳代培養(yǎng)(12hr)，高倍顯微鏡下，觀察納蟲泡的形成并計(jì)數(shù)，然后大量收集純化蟲株，用RT-PCR及Western-blot兩種方法對(duì)各組弓形蟲P24基因缺陷型蟲株的基因及其蛋白表達(dá)進(jìn)行分析，并對(duì)蟲株的毒力變化進(jìn)行了初步觀察。 研究結(jié)果：

5、 (1)弓形蟲TgP24基因敲除轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGB/P5-P3經(jīng)過PCR篩選、限制性酶切及DNA測(cè)序鑒定，證實(shí)P24 5'UTR和P24 3'UTR兩片段正確插入質(zhì)粒GRA2/Ble的KpnⅠ和BglⅡ及BamHⅠ和NotⅠ位點(diǎn)，位于藥物選擇ble基因的上，下游。 (2)顯微鏡檢查發(fā)現(xiàn)速殖子純度可達(dá)95％，濾膜過濾蟲體后，回收率也可達(dá)70％-80％；通過比較觀察發(fā)現(xiàn)，優(yōu)化電穿孔條件后的弓形蟲存活率得到提高；采用將細(xì)胞內(nèi)篩選和

6、細(xì)胞外藥物低溫處理相結(jié)合的方法對(duì)蟲株進(jìn)行篩選較徹底；采用L929成纖維細(xì)胞做為轉(zhuǎn)染蟲株篩選的宿主細(xì)胞其易貼壁生長形成單層，個(gè)體較大，細(xì)胞傳代次數(shù)多，生長速度較慢，并且對(duì)篩選藥物的耐受力為三種細(xì)胞中最理想的。 (3)高倍顯微鏡下計(jì)數(shù)，12hr左右轉(zhuǎn)染蟲株在細(xì)胞中納蟲泡數(shù)為8個(gè)/hp，明顯低于RH速殖子形成的納蟲泡數(shù)19個(gè)/hp；獲得的轉(zhuǎn)染蟲株經(jīng)RT-PCR，Western-blot檢測(cè)，結(jié)果顯示L929細(xì)胞篩選組蟲株的基因及蛋白水

7、平均明顯低于HFF和NIH-3T3細(xì)胞篩選組蟲株：動(dòng)物毒力試驗(yàn)結(jié)果表明，L929細(xì)胞篩選組蟲株感染小鼠的平均存活時(shí)間長于對(duì)照組RH蟲株。 結(jié)論： (1)成功構(gòu)建了弓形蟲P24基因敲除轉(zhuǎn)染質(zhì)粒pGB/P5-P3，并且插入的靶基因兩端的片段較長，有利于提高同源重組效率。 (2)確定了弓形蟲電穿孔技術(shù)的應(yīng)用條件以及TgP24基因敲除質(zhì)粒轉(zhuǎn)染蟲株在不同哺乳動(dòng)物細(xì)胞中的最佳篩選條件(采用細(xì)胞內(nèi)篩選和細(xì)胞外藥物低溫處理相結(jié)合