肝癌非手術(shù)患者p53熱點(diǎn)突變檢測(cè)暨人自噬標(biāo)簽Atg8家族蛋白變異剪接本的結(jié)構(gòu)分析.pdf

1、第一章肝癌非手術(shù)患者p53熱點(diǎn)突變檢測(cè)
　　肝癌的發(fā)生發(fā)展過程中會(huì)伴隨抑癌基因或原癌基因的突變。含有這些突變的DNA片段會(huì)被釋放到血液中，成為循環(huán)無細(xì)胞DNA(circulating-cell free DNA，cfDNA)。對(duì)cfDNA所攜帶信息進(jìn)行檢測(cè)可以間接獲知非手術(shù)肝癌患者體內(nèi)腫瘤細(xì)胞的遺傳變化。抑癌基因p53的突變與多種癌癥的預(yù)后相關(guān)。肝癌中p53的第249位密碼子AGG→AGT突變（導(dǎo)致p53 R249S突變）是中國(guó)和

2、撒哈拉以南非洲肝癌患者p53的高頻突變。本文設(shè)計(jì)并比較了PCR產(chǎn)物直接測(cè)序，高分辨率融解曲線分析(HRM)，特異性封阻PCR(ASB-realtime PCR)三種方法檢測(cè)患者血液中是否包含該突變。我們發(fā)現(xiàn)特異性封阻PCR有較好的靈敏度和特異性（靈敏度至少為每個(gè)反應(yīng)10拷貝，突變檢測(cè)的特異性底限可達(dá)0.1％）。對(duì)569例來自于江蘇啟東地區(qū)肝癌患者（421例非手術(shù)患者，148例手術(shù)患者）進(jìn)行檢測(cè)后，發(fā)現(xiàn)290例含有p53R249S突變(5

3、1.0％)。含有該突變的患者的總體生存時(shí)間與R249野生型患者相比，顯著縮短(HR=1.933，95％置信區(qū)間為1.591-2.349，P＜0.0001)。R249野生型p53的患者的中位生存時(shí)間為27.0個(gè)月(95％CI∶18.6-35.4)，p53 R249S突變的患者為7.0(95％CI∶5.6-8.4)個(gè)月，(P＜0.00001)。非手術(shù)患者中含有p53 R249S突變的中位生存時(shí)間為6.0個(gè)月，R249野生型的患者為16.0個(gè)

4、月。手術(shù)患者中，含有p53 R249S突變的中位生存時(shí)間為21.0個(gè)月，R249野生型的患者為61.0個(gè)月。另外，單位血漿中總p53基因片段多的患者預(yù)后較差，但是含有p53 R249S突變基因的患者中，突變片段含量同預(yù)后關(guān)系不明顯。這些結(jié)果證明ASB-realtime PCR是一種檢測(cè)cfDNA中突變的好方法，p53 R249S是肝癌預(yù)后的一個(gè)重要指標(biāo)。
　　第二章人自噬標(biāo)簽Atg8家族蛋白變異剪接本的結(jié)構(gòu)分析
　　自噬是真

5、核生物中一種保守的通過溶酶體對(duì)細(xì)胞內(nèi)物質(zhì)進(jìn)行降解的過程。Atg8和其同源蛋白已經(jīng)被證實(shí)在自噬過程中發(fā)揮重要作用。目前已知的人Atg8家族成員包括6種蛋白，分別為MAP1LC3A，MAP1 LC3B，MAP1LC3C（本文中分另簡(jiǎn)寫為L(zhǎng)C3A，LC3B，LC3C），GABARAP，GABARAPL1和GABARAPL2。這些蛋白的哪些氨基酸或結(jié)構(gòu)域?qū)τ谒麄兺渌鞍装l(fā)生互作，發(fā)揮生理功能是關(guān)鍵的，還不是很清楚。分析人Atg8家族蛋白的變異

6、剪接本可以為解決這些問題提供思路。
　　我們選擇LC3B作為重點(diǎn)研究對(duì)象，發(fā)現(xiàn)LC3B通過NAGNAG變異剪接可以產(chǎn)生一個(gè)缺少Arg68的變異剪接體，我們命名為L(zhǎng)C3B-b。這種新型的LC3B分子不能進(jìn)入正常的翻譯后修飾方式，也不能定位到自噬體上。在之前的同源結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果提示Arg68的缺失可能會(huì)影響LC3B-b分子在溶液中的構(gòu)象。因此，我們推測(cè)Arg68對(duì)于維持蛋白質(zhì)正常生理構(gòu)象有重要作用。通過溫度梯度的圓二色譜檢測(cè)和胰蛋白酶攻

7、擊實(shí)驗(yàn)表明，LC3B-b同正常剪接產(chǎn)生的LC3B-a相比，它對(duì)溫度更敏感，暴露的胰蛋白酶酶切位點(diǎn)更多，提示LC3B-b分子內(nèi)作用力減弱，結(jié)構(gòu)疏松，這與同源結(jié)構(gòu)模擬結(jié)果相符。這種構(gòu)象異常嚴(yán)重抑制半胱氨酸蛋白酶Atg4B對(duì)LC3B-b分子C末端的剪切，導(dǎo)致LC3B-b的類泛素化修飾和自噬體定位受阻。另一方面，我們將Arg68突變成Ala后，LC3B未被切割的pro型分子顯著增加，自噬體定位減少，細(xì)胞自噬水平降低。類似的現(xiàn)象在其他成員中同樣存

8、在。更進(jìn)一步的結(jié)構(gòu)分析顯示，LC3B的Arg68同Atg4B的Aspl71能形成鹽橋鍵，是兩者互作的關(guān)鍵位點(diǎn)。Pull-down實(shí)驗(yàn)證明，突變LC3B的Arg68會(huì)減弱兩者相互作用。體外酶切實(shí)驗(yàn)證實(shí)突變LC3B的Arg68或者ATG4B的Aspl71均會(huì)降低ATG4B的酶切效率。綜上，人Atg8家族蛋白的Arg68對(duì)于維持蛋白正常的溶液構(gòu)象，促進(jìn)蛋白相互作用有重要意義，是該家族蛋白發(fā)揮正常生理學(xué)功能的關(guān)鍵氨基酸。
　　為了進(jìn)一步探

9、討LC3B-b分子是否是可以被機(jī)體調(diào)控的具有生理學(xué)意義的功能分子，我們用熒光定量PCR特異性的檢測(cè)了LC3B-a與LC3B-b分子的mRNA表達(dá)情況。發(fā)現(xiàn)在人的不同組織和不同的癌細(xì)胞系中LC3B-b分子占總LC3B分子的比例存在差異。而且LC3B-b的表達(dá)比例在Hep3B細(xì)胞受到饑餓刺激或缺氧刺激時(shí)會(huì)發(fā)生變化。這種變化雖然比較微弱，但提示我們LC3B的NAGNAG變異剪接可能受到機(jī)體調(diào)控。我們選取了兩個(gè)含有與LC3B類似NAGNAG變異