FATS調(diào)控p53蛋白表達(dá)的分子機(jī)制.pdf

1、目的:
　　通過分子和細(xì)胞生物學(xué)手段研究新的脆性位點(diǎn)基因FATS調(diào)控p53表達(dá)的分子機(jī)制，包括FATS與p53蛋白之間的相互作用、DNA損傷信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)中FATS對(duì)p53蛋白的共價(jià)修飾、轉(zhuǎn)錄活性及蛋白穩(wěn)定性的影響，進(jìn)一步確定FATS的抑癌基因性質(zhì)，揭示FATS基因表達(dá)與p53功能之間的正反饋調(diào)節(jié)關(guān)系。
　　方法:
　　1.用FATS表達(dá)載體轉(zhuǎn)染細(xì)胞，24小時(shí)后提取細(xì)胞總蛋白或總RNA。用Westernblot實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中

2、p53蛋白的表達(dá)量；進(jìn)行RT-PCR實(shí)驗(yàn)檢測(cè)細(xì)胞中p53mRNA表達(dá)水平，分析FATS對(duì)p53表達(dá)的影響。
　　2.用FATS表達(dá)載體或FATS-shRNA轉(zhuǎn)染細(xì)胞后，用蛋白合成抑制劑Cycloheximide(CHX)或DNA損傷化學(xué)誘導(dǎo)劑Etoposide處理細(xì)胞，Westernblot檢測(cè)細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)量，分析FATS對(duì)p53蛋白的穩(wěn)定性及DNA損傷后FATS對(duì)p53蛋白磷酸化和乙酰化修飾的影響。
　　3.FA

3、TS表達(dá)載體單獨(dú)或與p53表達(dá)載體共轉(zhuǎn)細(xì)胞后，免疫共沉淀(IP)法檢測(cè)FATS蛋白與p53蛋白的細(xì)胞內(nèi)相互作用。
　　4.用FATS原核表達(dá)載體GS-FATS(1-363)轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，IPTG誘導(dǎo)，純化GST-FATS(1-363)蛋白，用于蛋白質(zhì)相互作用研究。
　　5.利用體外轉(zhuǎn)錄和體外翻譯偶聯(lián)系統(tǒng)(TNT，Promega試劑盒)從p53表達(dá)載體直接得到純化的p53蛋白。
　　6.用純化的GST-FATS(

4、1-363)蛋白與p53蛋白進(jìn)行體外蛋白結(jié)合(GST-pull-down)實(shí)驗(yàn)，研究FATS蛋白N-端與p53蛋白是否發(fā)生直接的相互作用。
　　7.用染色質(zhì)免疫沉淀的方法檢測(cè)FATS對(duì)MEF(p53野生型)細(xì)胞中p53結(jié)合p21啟動(dòng)子的影響。
　　8.用受控于p21基因啟動(dòng)子的熒光酶報(bào)告基因載體pGL2-p21-1uc與p53、FATS表達(dá)載體單獨(dú)或共轉(zhuǎn)H1299(p53表達(dá)沉默)細(xì)胞，用熒光酶報(bào)告基因分析試劑盒和熒光酶活性

5、檢測(cè)儀檢測(cè)樣品中熒光酶活性，進(jìn)一步分析FATS對(duì)p53轉(zhuǎn)錄因子活性的影響。
　　結(jié)果:
　　1.與對(duì)照組細(xì)胞相比較，F(xiàn)ATS過表達(dá)使細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)水平明顯升高；用FATS-shRNA抑制細(xì)胞內(nèi)源FATS表達(dá)之后，細(xì)胞中p53蛋白的表達(dá)量明顯降低。
　　2.FATS表達(dá)對(duì)p53mRNA表達(dá)水平?jīng)]有影響。
　　3.用蛋白合成抑制劑Cycloheximide(CHX)處理細(xì)胞后，F(xiàn)ATS表達(dá)能顯著抑制細(xì)胞內(nèi)p5

6、3蛋白的降解。
　　4.免疫共沉淀和GSTpull-down結(jié)果顯示FATS蛋白能與p53蛋白在體內(nèi)和體外發(fā)生相互作用，F(xiàn)ATS蛋白N端(1-363)區(qū)域直接與p53蛋白結(jié)合。
　　5.DNA損傷后，F(xiàn)ATS能進(jìn)一步上調(diào)p53蛋白的表達(dá)量，并且增強(qiáng)p53蛋白的乙?；土姿峄?。
　　6.FATS表達(dá)能顯著提高p53下游靶基因p21的mRNA表達(dá)水平，并促進(jìn)p53與p21啟動(dòng)子的結(jié)合；熒光酶報(bào)告基因檢測(cè)結(jié)果顯示FATS

7、本身沒有轉(zhuǎn)錄因子活性，其對(duì)p21轉(zhuǎn)錄水平的調(diào)節(jié)是p53依賴性的。
　　結(jié)論:
　　1.FATS通過增加p53穩(wěn)定性而誘導(dǎo)p53表達(dá)。
　　2.FATS是一個(gè)p53蛋白結(jié)合蛋白，通過其N-端與p53蛋白發(fā)生直接相互作用。
　　3.FATS促進(jìn)DNA損傷后p53的激活，包括進(jìn)一步增強(qiáng)p53蛋白穩(wěn)定性和其磷酸化、乙?；揎?。
　　4.FATS上調(diào)p53蛋白的轉(zhuǎn)錄因子活性，是p53-p21信號(hào)通路的強(qiáng)有力正調(diào)控因子