腫瘤抑制蛋白p53通過microRNAs調(diào)控B7-H1表達(dá)的研究.pdf

1、第一部分P53敲除A375細(xì)胞系的建立
　　目的：利用CRISPR/CAS9系統(tǒng)建立p53敲除的細(xì)胞系
　　方法：設(shè)計(jì)兩條針對(duì)人的p53基因的gRNA，分別將兩條 gRNA插入pBT-U6-Cas9-2A-GFP表達(dá)質(zhì)粒，然后將含有不同 gRNA的質(zhì)粒分別轉(zhuǎn)染進(jìn)入 K562細(xì)胞，用SUVEYOR突變檢測試劑盒，對(duì)兩條設(shè)計(jì)的gRNA的剪切效率進(jìn)行比較，選取效率較高gRNA進(jìn)行后續(xù)p53敲除。在A375細(xì)胞中轉(zhuǎn)染GFP標(biāo)記含有g(shù)

2、RNA和CAS9核酸酶的質(zhì)粒，驗(yàn)證突變，同時(shí)流式分選出GFP陽性的細(xì)胞。將分選出的細(xì)胞，分別單個(gè)接種于96孔板，待其克隆形成。部分克隆形成之后，將其擴(kuò)增傳代，形成單克隆細(xì)胞系。為從中篩選出p53敲除細(xì)胞，首先我們使用x-ray處理所有獲得克隆，然后免疫電泳檢測所有克隆中p53的表達(dá)情況，選出p53表達(dá)陰性的克隆進(jìn)行測序，以驗(yàn)證p53敲除的可靠性。同時(shí)也對(duì)X射線刺激細(xì)胞，然后對(duì)p53下游基因p21進(jìn)行檢測，以在功能上確認(rèn)p53的敲除。

3、r>　　結(jié)果：SUVEYOR結(jié)果顯示設(shè)計(jì)的兩條gRNA均可以造成突變，編輯效率第一條gRNA較好。使用gRNA1轉(zhuǎn)染A375細(xì)胞，SUVEYOR檢測到突變發(fā)生。Western檢測p53在各個(gè)克隆中的表達(dá)發(fā)現(xiàn)，在獲得的23個(gè)克隆中，有3個(gè)克隆在p53位置出現(xiàn)了缺失，敲除效率為3/23.同時(shí)使用PCR對(duì)敲除位點(diǎn)進(jìn)行了擴(kuò)增，相比正常WT p53條帶，所獲得疑似敲除克隆的p53條帶位置均發(fā)生了變化。測序結(jié)果顯示，所獲得三個(gè)陽性克隆p53基因段均

4、發(fā)生了明顯的基因插入或者缺失，導(dǎo)致了p53表達(dá)的失調(diào)。最后對(duì)p53下游基因p21的表達(dá)進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)所獲克隆中，在p53已被激活的情況下，p21的表達(dá)全部缺失。
　　結(jié)論：利用CRISPR/CAS9系統(tǒng)，成功敲除p53基因，獲得了穩(wěn)定遺傳的p53完全敲除和p53變異細(xì)胞株。
　　第二部分 p53通過microRNAs抑制B7-H1的表達(dá)
　　目的：研究p53敲除后是否對(duì)細(xì)胞B7-H1的表達(dá)造成影響以及通過何種機(jī)制影響其

5、表達(dá)
　　方法：分別用流式檢測A375，HCT116和其p53敲除前后的B7-H1表達(dá)；使用RT-PCR檢測 B7-H1的信使 RNA在 A375，HCT116和其 p53敲除細(xì)胞系中的表達(dá)；使用microRNA芯片檢測A375和A375Δp53細(xì)胞之間的microRNA表達(dá)差異，并結(jié)合B7-H1靶點(diǎn)預(yù)測，從而篩選出可能具有對(duì)B7-H1具有調(diào)控功能的microRNAs；將篩選出來的microRNAs mimics轉(zhuǎn)染A375Δp5

6、3細(xì)胞，觀察B7-H1在各個(gè)不同mimics轉(zhuǎn)染后的表達(dá)情況，選擇出調(diào)控B7-H1表達(dá)的microRNA；使用特異性inhibitors同mimics一同轉(zhuǎn)染A375Δp53細(xì)胞，以確認(rèn)microRNA作用的特異性；使用qRT-PCR檢測A375，HCT116和其 p53敲除前后以及使用 siRNA敲除 p53之后的microRNA-34a以及microRNA-200b表達(dá)，以驗(yàn)證p53對(duì)microRNA-34a以及microRNA-2

7、00b表達(dá)的調(diào)控作用，并使用免疫電泳對(duì)p53以及B7-H1的表達(dá)進(jìn)行檢測。構(gòu)建雙熒光報(bào)告載體驗(yàn)證microRNA-34a以及microRNA-200b靶向作用于B7-H1的3UTR。
　　結(jié)果：當(dāng)p53缺失時(shí)，通過流式檢測發(fā)現(xiàn)B7-H1的表達(dá)在A375，HCT116細(xì)胞中均明顯上升；之后，對(duì)B7-H1的信使RNA表達(dá)水平進(jìn)行檢測，發(fā)現(xiàn)p53的敲除，并不影響B(tài)7-H1 mRNA的表達(dá)，結(jié)果無顯著性差異；通過篩選，并結(jié)合靶向預(yù)測，我們

8、發(fā)現(xiàn)在p53敲除前后，有8個(gè)候選microRNAs可能調(diào)控B7-H1表達(dá)。轉(zhuǎn)染mimics后發(fā)現(xiàn)，microRNA-34a和microRNA-200b可下調(diào)B7-H1在A375Δp53細(xì)胞中的表達(dá)，差異明顯。在加入microRNA-34a和microRNA-200b inhibitors共轉(zhuǎn)染時(shí)，這種下調(diào)效果可被消除。實(shí)時(shí)定量PCR檢測發(fā)現(xiàn)，在p53敲除或敲低的情況下，microRNA-34a和microRNA-200b表達(dá)明顯下降，同

9、時(shí)B7-H1的表達(dá)上調(diào)。雙熒光素報(bào)告載體檢測發(fā)現(xiàn)，microRNA-34a和microRNA-200b可特異性結(jié)合域B7-H1的3’UTR端調(diào)控轉(zhuǎn)錄。
　　結(jié)論：p53的敲除下調(diào) microRNA-34a和 microRNA-200b的表達(dá)，從而抑制microRNA-34a和microRNA-200b對(duì)B7-H1信使RNA的作用，導(dǎo)致B7-H1蛋白表達(dá)上升。
　　第三部分 microRNA-34a和microRNA-200b

10、調(diào)控Jurkat增殖和細(xì)胞因子分泌
　　目的：研究microRNA-34a和 microRNA-200b通過調(diào)控 B7-H1分子從而影響 Jurkat細(xì)胞的功能，介導(dǎo)免疫抑制。
　　方法：培養(yǎng)Jurkat細(xì)胞，用TPA刺激，誘導(dǎo)其表達(dá)PD-1受體，免疫電泳檢測誘導(dǎo)表達(dá)效果；將誘導(dǎo)表達(dá)PD-1的Jurkat細(xì)胞同A375Δp53細(xì)胞共培養(yǎng)，利用B7-H1阻斷性抗體抑制 B7-H1/PD-1通路的激活，觀察 Jurkat細(xì)胞的增

11、殖情況。在使用microRNA-34a和microRNA-200b的mimics和inhibitors分別轉(zhuǎn)染A375Δp53細(xì)胞后同Jurkat細(xì)胞共培養(yǎng)，以觀察microRNA-34a和microRNA-200b對(duì)細(xì)胞造成的增殖改變。同時(shí)收集共培養(yǎng)細(xì)胞的上清培養(yǎng)液，檢測microRNA-34a和microRNA-200b對(duì)細(xì)胞分泌IFN-gamma，IL-2細(xì)胞因子的影響。
　　結(jié)果：jurkat細(xì)胞在 TPA刺激后，其 PD

12、-1的表達(dá)明顯增強(qiáng)。將刺激后的細(xì)胞同A375Δp53細(xì)胞共培養(yǎng)，其增殖受到明顯抑制，在用B7-H1抗體阻斷后，此種增值抑制效應(yīng)可以得到解除；同時(shí)，結(jié)果顯示，A375Δp53細(xì)胞相對(duì)于A375細(xì)胞更能明顯抑制Jurkat細(xì)胞增殖。在A375Δp53細(xì)胞中轉(zhuǎn)染進(jìn)microRNA-34a和microRNA-200b的mimics后可以部分消除對(duì)Jurkat細(xì)胞的增殖抑制效應(yīng)，加入對(duì)應(yīng)inhibitors，可以恢復(fù)對(duì)Jurkat細(xì)胞的抑制。同時(shí)

13、對(duì)細(xì)胞因子的檢測發(fā)現(xiàn)，A375Δp53細(xì)胞表達(dá)B7-H1抑制Jurkat細(xì)胞的細(xì)胞因子分泌，microRNA-34a和microRNA-200b的mimics轉(zhuǎn)染可以有效解除抑制效果，共轉(zhuǎn)染對(duì)應(yīng)inhibitors可以使得分泌再次被抑制。
　　結(jié)論：PD-1/B7-H1通路的激活可以抑制Jurkat細(xì)胞的增殖。A375Δp53細(xì)胞相比A375細(xì)胞具有更強(qiáng)的免疫抑制能力，此種抑制效應(yīng)同microRNA-34a和microRNA-20