KRAB型鋅指蛋白家族中p53調(diào)控分子的篩選及功能研究.pdf

1、抑癌蛋白p53是目前已知與人類腫瘤發(fā)生發(fā)展最為密切相關(guān)的分子之一，也是控制細胞增殖、凋亡的蛋白網(wǎng)絡(luò)的節(jié)點分子。在機體受到細胞應(yīng)激如DNA損傷、癌基因激活、化學藥物處理、熱/冷休克等多種因素的刺激下，p53作為一種重要的轉(zhuǎn)錄因子，被激活，選擇性調(diào)控其下游與細胞周期阻滯、細胞凋亡或DNA損傷修復(fù)相關(guān)的靶基因的表達，引起細胞周期阻滯或誘導(dǎo)細胞凋亡。多種分子能夠通過與p53相互作用選擇性調(diào)控其靶基因，如Hzf、CAS/CSEIL、ASPP1和A

2、SPP2等。對p53的精密調(diào)節(jié)在維持細胞的正常生長和防止癌變等方面起著非常重要的作用。 含有KRAB（Kruppel-associated box）結(jié)構(gòu)域的鋅指蛋白（KZNF）是人類基因組中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，KZNF通過與其轉(zhuǎn)錄抑制輔因子KAP-1(KRABbox-associated protein-1)及其它轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合，發(fā)揮特異的轉(zhuǎn)錄抑制功能。本實驗室的前期研究鑒定了一個新的KZNF成員，命名為Apak（ATM a

3、nd p53 associated KZNF protein），它是一種新的p53負調(diào)控分子，非應(yīng)激條件下，Apak通過其鋅指區(qū)和KRAB結(jié)構(gòu)域分別與p53和KAP-1相結(jié)合，KAP-1招募蛋白激酶ATM和組蛋白去乙?；窰DAC1復(fù)合物抑制p53的乙酰化，從而下調(diào)p53的轉(zhuǎn)錄因子活性，更為重要的是，Apak選擇性地下調(diào)p53的凋亡相關(guān)靶基因表達，抑制p53介導(dǎo)的細胞凋亡，而對細胞周期沒有調(diào)控作用。同時還發(fā)現(xiàn)非應(yīng)激條件下，Apak抑制p

4、53活性依于ATM的存在，在DNA損傷條件下，Apak又依賴ATM對其的磷酸化與p53解離、從而解除對p53的抑制、激活p53，因此揭示了ATM在p53調(diào)控中的雙重作用。這些前期結(jié)果揭示了KZNF家族成員在p53選擇性調(diào)控中的重要功能及其分子機制。作為哺乳動物中最大的轉(zhuǎn)錄調(diào)控因子家族，其成員數(shù)量多達400多個，除了Apak外，還有多少成員可具有類似Apak的功能參與p53調(diào)控，各成員間的協(xié)同關(guān)系又是怎樣的都還很不清楚，這些也正是本課題擬

5、探討的科學問題。 本論文首先利用生物信息學方法從KZNF家族423個成員篩選出含有ATM底物磷酸化位點SQ/TQ模序的48個成員，進行了進化樹分析，明確了它們在起源進化上的關(guān)系。隨后成功構(gòu)建了其中的21個成員的真核細胞表達質(zhì)粒，利用報告基因活性分析體系檢測了這21個成員對p53轉(zhuǎn)錄因子活性的調(diào)控，篩選得到5個成員(即ZNF8、ZNF195、ZNF248、ZNF566、ZNF568)對p53的轉(zhuǎn)錄因子活性具有較強的下調(diào)作用。最后

6、又根據(jù)KRAB結(jié)構(gòu)域類型和對p53轉(zhuǎn)錄活性抑制效果的不同選擇了21個KZNF成員的部分分子，通過蛋白-蛋白相互作用技術(shù)研究了它們與p53、ATM的結(jié)合關(guān)系，在檢測的12個成員中8個可以和p53相互作用，在檢測的4個成員中，2個可以和ATM相互作用，能夠同時與ATM和p53相互作用的KZNF蛋白均可以顯著下調(diào)p53轉(zhuǎn)錄因子活性，表明KZNF家族中的確存在類似Apak的同源分子，它們對p53的調(diào)控功能與其結(jié)合ATM、p53的能力密切相關(guān)。

7、 綜上，本論文在實驗室前期研究基礎(chǔ)上，進一步研究了KZNF家族在重要抑癌蛋白p53復(fù)雜調(diào)控網(wǎng)絡(luò)中的可能作用，序列分析搜索到了全部48個可能作為候選ATM底物的KZNF成員，成功克隆了其中的21個成員，篩選出多個對p53活性具有抑制功能的分子，從而進一步證實KZNF家族確實存在更多的p53調(diào)控蛋白。本研究對加深理解KZNF家族的生理功能具有重要的原創(chuàng)性價值，有助于解釋p53調(diào)控的時空復(fù)雜性，為靶向p53及其調(diào)控分子的腫瘤治療提供了