海馬內(nèi)注射脂多糖導(dǎo)致大鼠癇性發(fā)作及其機(jī)制.pdf

1、癲癇(Epilepsy)是以大腦神經(jīng)元過度放電為特征的中樞神經(jīng)系統(tǒng)臨床綜合征，是嚴(yán)重危害人類健康的神經(jīng)系統(tǒng)常見慢性疾病之一。癲癇發(fā)作影響了0.5％-1.5％的全球人口，給患者個人、家庭和社會帶來了沉重負(fù)擔(dān)，是神經(jīng)科學(xué)研究的熱點(diǎn)。有大約20-30％的癲癇患者經(jīng)過規(guī)范使用一線抗癲癇藥物治療后不能有效控制發(fā)作而成為難治性癲癇。難治性癲癇是目前醫(yī)學(xué)上急需解決的問題之一。難治的原因除了癲癇病因復(fù)雜，還與目前癲癇發(fā)作的發(fā)病機(jī)制仍不明確，不能根據(jù)發(fā)作

2、機(jī)制中的關(guān)鍵環(huán)節(jié)開發(fā)新藥物、尋求新的治療途徑有關(guān)。顳葉癲癇是難治性癲癇中最常見的綜合征，一直以來都是臨床癲癇治療的難點(diǎn)。近幾十年來，對顳葉癲癇發(fā)病機(jī)制的研究持續(xù)成為癲癇研究的熱點(diǎn)。大量的研究表明：顳葉癲癇的解剖起源位于海馬，其主要的病理基礎(chǔ)是海馬硬化，主要表現(xiàn)為神經(jīng)元丟失和膠質(zhì)細(xì)胞增生。
　　 目前，沒有任何一種抗癲癇藥物能夠阻止癲癇敏感個體在受到顱內(nèi)感染、腦外傷及熱性驚厥等中樞神經(jīng)系統(tǒng)損害后癲癇發(fā)作的發(fā)生和發(fā)展。最近的研究提示

3、：癲癇發(fā)作，有可能由腦的免疫反應(yīng)易化或觸發(fā)。持續(xù)的炎癥可能是慢性癲癇的一個基本機(jī)制。
　　 近年來，膠質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)在癲癇發(fā)病機(jī)制中的作用成為研究的熱點(diǎn)。膠質(zhì)細(xì)胞廣泛分布于中樞神經(jīng)系統(tǒng)，主要包括星形膠質(zhì)細(xì)胞、小膠質(zhì)細(xì)胞、少突膠質(zhì)細(xì)胞和室管膜細(xì)胞，具有支持、滋養(yǎng)神經(jīng)元的作用，并在神經(jīng)系統(tǒng)損傷時有分裂增殖與再生修復(fù)等作用。膠質(zhì)細(xì)胞中的小膠質(zhì)細(xì)胞和星形膠質(zhì)細(xì)胞，與炎癥誘發(fā)的免疫反應(yīng)有關(guān)，負(fù)責(zé)對可能導(dǎo)致癲癇發(fā)作的腦損傷的監(jiān)視。

4、　　 脂多糖(LPS)，亦稱內(nèi)毒素，是革蘭陰性菌細(xì)胞壁的主要成分之一?？杀籘oll樣受體4識別并激活膠質(zhì)細(xì)胞的固有免疫反應(yīng)，是致炎劑中目前研究最透徹、最經(jīng)典的，并且也是最常用的。
　　 一氧化氮(NO)在癲癇發(fā)生中的作用已得到廣泛關(guān)注。NO是一種氣體分子介質(zhì)，由L精氨酸經(jīng)一氧化氮合酶(NOS)催化生成，中樞神經(jīng)系統(tǒng)中有3種NOS同工酶，即誘導(dǎo)型(iNOS)、神經(jīng)元型(nNOS)、內(nèi)皮型(eNOS)。其中nNOS是腦組織中含量最

5、多的NOS同工酶，其催化生成的NO以擴(kuò)散方式直接作用于鄰近細(xì)胞。研究證實(shí)海馬CA區(qū)NO過度表達(dá)可致癲癇的反復(fù)發(fā)作，造成神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞的增生和神經(jīng)元的缺失。大量研究顯示NO參與了癲癇發(fā)作的發(fā)生發(fā)展。
　　 細(xì)胞因子是一組多肽或蛋白，其經(jīng)典功能是介導(dǎo)和調(diào)節(jié)免疫應(yīng)答，刺激造血功能，參與組織修復(fù)等。近年的研究表明，神經(jīng)膠質(zhì)細(xì)胞具有細(xì)胞因子受體并能合成和分泌多種細(xì)胞因子。白細(xì)胞介素-1β(Interleukin-1β，IL-1β)和腫瘤壞死

6、因子-α(Tumor necrosis factor-alpha，TNF-α)是兩種重要的細(xì)胞因子，臨床癲癇患者血清中二者含量升高，推測與癲癇發(fā)病有關(guān)。對大鼠癲癇模型的研究結(jié)果顯示IL-1β和TNF-α在癲癇發(fā)作急慢性期的腦組織中均高表達(dá)，提示其可能參與了癲癇的形成過程。對星形膠質(zhì)細(xì)胞培養(yǎng)給予LPS刺激可導(dǎo)致IL-1和TNFa的產(chǎn)生。然而激活TLR4對星形膠質(zhì)細(xì)胞的作用尚未在體內(nèi)證實(shí)。
　　 目前有研究證明在癲癇實(shí)驗(yàn)?zāi)Ｐ椭泄逃忻?/p>

7、疫反應(yīng)可降低癲癇發(fā)作的閾值，但目前尚無可以證實(shí)固有免疫反應(yīng)可以單獨(dú)在活體內(nèi)導(dǎo)致癲癇發(fā)作的研究。本實(shí)驗(yàn)采用LPS海馬內(nèi)注射引發(fā)中樞神經(jīng)系統(tǒng)的炎癥反應(yīng)，模擬中樞神經(jīng)系統(tǒng)對損傷和感染的炎癥反應(yīng)，明確炎癥是否可作為獨(dú)立的致癇因子，單獨(dú)在活體內(nèi)導(dǎo)致急性及慢性癲癇發(fā)作，能否引起海馬硬化的病理改變。并初步探討其致癇機(jī)制：研究LPS海馬內(nèi)注射是否能導(dǎo)致大鼠海馬神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)表達(dá)的改變，監(jiān)測LPS體內(nèi)激活TLR4對IL-1β和TNF-α表

8、達(dá)的作用。本研究分三個部分：
　　 第一部分海馬內(nèi)注射脂多糖導(dǎo)致大鼠癇性發(fā)作及海馬硬化
　　 目的：
　　 研究海馬內(nèi)注射脂多糖是否可激活膠質(zhì)細(xì)胞的免疫反應(yīng)，引起大鼠急性癇性發(fā)作和慢性期自發(fā)性癇性發(fā)作，是否可導(dǎo)致海馬硬化。
　　 方法：
　　 1.36只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組(每組12只)，在大鼠CA3區(qū)應(yīng)用立體定位儀分別注射1.5μl脂多糖(5ug/ul)，生理鹽水，海人酸(0.4

9、ug/ul)。并分別于運(yùn)動感覺皮層區(qū)及注射點(diǎn)對側(cè)海馬處置入電極，從給藥開始連續(xù)記錄大鼠腦電變化和監(jiān)測大鼠蘇醒后行為學(xué)變化2 h。大鼠行為學(xué)改變采用Racine標(biāo)準(zhǔn)進(jìn)行評分；
　　 2.于海馬內(nèi)注射后30d，各組大鼠用多聚甲醛心臟灌注后取腦，固定，石蠟包埋，將右側(cè)海馬區(qū)組織制成組織切片，行HE染色，顯微鏡下觀察右側(cè)海馬CA1、CA2、CA3區(qū)和齒狀回門區(qū)(dentate gyrus，DG)神經(jīng)元的形態(tài)及其數(shù)目分布；
　　

10、3.于海馬內(nèi)注射后30d，將右側(cè)海馬區(qū)組織制成組織切片，通過應(yīng)用免疫組化法檢測大鼠右側(cè)海馬各分區(qū)及DG區(qū)膠質(zhì)纖維酸性蛋白(GFAP)的表達(dá)，觀察星形膠質(zhì)細(xì)胞的形態(tài)學(xué)表現(xiàn)，并行顯微鏡下GFAP陽性細(xì)胞計(jì)數(shù)；
　　 4.所有切片分析在同一強(qiáng)度，同一放大倍數(shù)下進(jìn)行。每只大鼠隨機(jī)取相同部位的6張切片，分別對海馬各分區(qū)陽性細(xì)胞進(jìn)行計(jì)數(shù)。采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，所有數(shù)據(jù)以x±s表示。采用t檢驗(yàn)，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。

11、
　　 結(jié)果：
　　 1.海馬內(nèi)注射后NS組大鼠未見癇性發(fā)作。LPS組和KA組大鼠海馬內(nèi)注射后2 h內(nèi)出現(xiàn)不同程度的癇性發(fā)作，KA組發(fā)作等級高于LPS組。部分LPS和KA組大鼠在給藥后3-4周仍可見癲癇發(fā)作。
　　 2.海馬內(nèi)注射后2h內(nèi)NS組大鼠腦電圖呈基本節(jié)律(基礎(chǔ)腦電10-20 Hz、35～60μV)，LPS組或KA組腦電圖可見異常放電(尖波或棘波6～50Hz，60～220μV)。
　　 3.海馬內(nèi)

12、注射30d后取材行HE染色示：KA組和LPS組大鼠海馬各區(qū)及齒狀回(dentate gyrus，DG)均可見神經(jīng)細(xì)胞排列松散、紊亂、形狀模糊。兩組各區(qū)細(xì)胞數(shù)明顯少于NS組(P<0.05)。行GFAP染色示：NS組海馬各區(qū)及DG區(qū)可見少量GFAP陽性細(xì)胞表達(dá)，KA組和LPS組GFAP陽性細(xì)胞數(shù)顯著多于NS組(P<0.05)，并可見胞體增生肥大、細(xì)胞樹突變長增粗肥大畸形，細(xì)胞排布紊亂，廣泛侵入神經(jīng)元脫失的錐體細(xì)胞層，形成膠質(zhì)瘢痕。
　

13、　 4.海馬內(nèi)注射30d后KA組和LPS組大鼠海馬均存在神經(jīng)元缺失和膠質(zhì)細(xì)胞增生，有不同程度的海馬硬化表現(xiàn)。
　　 結(jié)論：
　　 根據(jù)海馬內(nèi)注射后大鼠行為學(xué)和EEG的改變證實(shí)海馬內(nèi)注射LPS可致大鼠急性癲癇發(fā)作和慢性期自發(fā)發(fā)作，LPS可導(dǎo)致神經(jīng)細(xì)胞缺失，并激活膠質(zhì)細(xì)胞導(dǎo)致膠質(zhì)瘢痕形成海馬硬化。
　　 第二部分海馬內(nèi)注射LPS對大鼠海馬神經(jīng)型一氧化氮合酶表達(dá)的影響
　　 目的：
　　 研究海馬內(nèi)注

14、射LPS后的急性期大鼠海馬神經(jīng)型一氧化氮合酶(nNOS)表達(dá)的變化，以探討LPS的致癇機(jī)制。
　　 方法：
　　 1.36只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為3組(每組各12只)，應(yīng)用立體定位法在大鼠CA3區(qū)分別注射1.5μl脂多糖(5ug/ul)，生理鹽水，海人酸(0.4ug/ul)；
　　 2.于海馬內(nèi)注射后6h，將各組大鼠用多聚甲醛心臟灌注后取腦，固定，經(jīng)石蠟包埋后，將右側(cè)海馬區(qū)組織制成組織切片，采用免疫組化

15、法檢測右側(cè)海馬CA1、CA2、CA3區(qū)和DG區(qū)nNOS的表達(dá)；
　　 3.所有切片分析在同一強(qiáng)度，同一放大倍數(shù)下進(jìn)行。每只大鼠隨機(jī)取相同部位的6張切片，分別對右側(cè)海馬各分區(qū)nNOS陽性細(xì)胞進(jìn)行觀察測定。
　　 結(jié)果：
　　 1.nNOS表達(dá)陽性細(xì)胞胞漿及突起呈棕色或棕褐色著色。
　　 2.海馬內(nèi)注射6h后NS組大鼠海馬各區(qū)神經(jīng)元胞漿可見少量的nNOS表達(dá)，陽性物質(zhì)顆粒呈棕黃色，顆粒稀疏。
　　 3

16、.海馬內(nèi)注射6h后KA組大鼠海馬區(qū)區(qū)神經(jīng)元胞漿鏡下見陽性物質(zhì)染色深，顆粒粗。
　　 4.海馬內(nèi)注射6h后LPS組海馬區(qū)神經(jīng)元胞漿陽性物質(zhì)染色介于KA組和NS組之間。
　　 結(jié)論：
　　 LPS海馬內(nèi)注射可引起海馬區(qū)nNOS表達(dá)的提高，導(dǎo)致神經(jīng)元的損傷，推測其可能為LPS致癇的機(jī)制之一。
　　 第三部分 LPS致癇大鼠海馬細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α水平變化
　　 目的：
　　 研究LPS

17、海馬內(nèi)注射對大鼠海馬細(xì)胞因子IL-1β、TNF-α水平變化的影響。
　　 方法：
　　 1.84只成年雄性Wistar大鼠隨機(jī)分為2組，立體定位在大鼠CA3區(qū)分別注射1.5μ LPS(5ug/ul)，生理鹽水。
　　 2.給藥后，分別于0.5h，2h，6h，12h，18h，24h，36h時間點(diǎn)將各組大鼠斷頭取腦，冰上快速分離海馬，冰冷生理鹽水沖洗后，放-80℃冰箱保存?zhèn)溆谩?br>　　 3.標(biāo)本加入5倍體積0.

18、1M PBS(內(nèi)含1μg/L蛋白酶抑制劑)，冰浴中充分研磨，2500×g離心20min，取上清液檢測。
　　 4.嚴(yán)格按照Elisa試劑盒說明書進(jìn)行IL-1β和TNF-α濃度檢測。
　　 5.統(tǒng)計(jì)學(xué)分析，數(shù)據(jù)以均數(shù)±標(biāo)準(zhǔn)差(x±s)表示，采用t檢驗(yàn)。統(tǒng)計(jì)分析采用SPSS17.0統(tǒng)計(jì)軟件進(jìn)行分析，P<0.05為差異有統(tǒng)計(jì)學(xué)意義。
　　 結(jié)果：
　　 1.LPS組大鼠海馬內(nèi)注射后0.5h，2h，6h，12h，

19、18h，24h，36h各時間點(diǎn)IL-1β和TNF-α濃度均高于生理鹽水組(P<0.05)。
　　 2.LPS組大鼠海馬內(nèi)注射后IL-1β濃度逐漸升高，至18h濃度達(dá)到高峰，其后出現(xiàn)下降趨勢。生理鹽水對照組各時間段數(shù)值未見明顯變化趨勢，各組間差異無顯著性(P>0.05)
　　 3.LPS組大鼠海馬內(nèi)注射后TNF-α濃度升高，至2h濃度達(dá)到高峰，其后出現(xiàn)下降趨勢。生理鹽水對照組18h時濃度較其它時間段高，但無顯著性(P>0.

20、05)。
　　 結(jié)論：
　　 LPS大鼠海馬內(nèi)注射可激活固有免疫反應(yīng)，導(dǎo)致海馬內(nèi)細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α的濃度升高。IL-1β于注射后18h達(dá)到高峰，TNF-α于注射后2h達(dá)到高峰。
　　 研究意義：
　　 本研究首次發(fā)現(xiàn)海馬內(nèi)注射LPS可導(dǎo)致大鼠急性期和慢性期癲癇發(fā)作。在急性期導(dǎo)致海馬區(qū)nNOS表達(dá)和細(xì)胞因子IL-1β和TNF-α濃度的提高，并于癲癇發(fā)作的慢性期導(dǎo)致海馬硬化的發(fā)生。由此初步探討其機(jī)