COX-2及其抑制劑在幼鼠癇性發(fā)作中的作用及機(jī)制研究.pdf

1、研究背景及目的： 大量臨床回顧性研究資料表明，在伴有海馬硬化性顳葉癲癇的成人患者中有相當(dāng)高比例可追問(wèn)到兒童早期有長(zhǎng)時(shí)間癇性發(fā)作史，尤其是高熱驚厥.幼年早期長(zhǎng)時(shí)間癇性發(fā)作后大腦可塑性發(fā)生的改變對(duì)個(gè)體能產(chǎn)生長(zhǎng)遠(yuǎn)的影響，與海馬硬化性顳葉癲癇的形成密切相關(guān)。海馬環(huán)路內(nèi)的軸突出芽、突觸重建是顳葉癲癇的主要的病理生理特征，在顳葉癲癇的形成與維持中發(fā)揮重要作用。在癲癇形成過(guò)程中，神經(jīng)元之間形成異常的突觸聯(lián)系，建立了病理性(功能性或形態(tài)性)神經(jīng)

2、環(huán)路。海馬突觸聯(lián)系的可塑性是癲癇發(fā)生后突觸重建的基礎(chǔ)。癲癇發(fā)作可導(dǎo)致神經(jīng)系統(tǒng)膠質(zhì)增生，突觸后終端與膠質(zhì)細(xì)胞之間形成突觸，突觸后終端的樹突棘的形態(tài)學(xué)的變化引起突觸結(jié)構(gòu)的改變，與膠質(zhì)細(xì)胞之間形成的突觸為異位突觸；同時(shí)癇性發(fā)作也導(dǎo)致異常神經(jīng)發(fā)生，引起顆粒細(xì)胞層彌散，新生的顆粒神經(jīng)元有較多的基部樹突向齒狀回投射，引起海馬內(nèi)環(huán)路性質(zhì)的變化，成為慢性反復(fù)性癇性發(fā)作的基礎(chǔ)。環(huán)氧合酶-2(COX-2)及其代謝產(chǎn)物在中樞起多種調(diào)節(jié)作用，與長(zhǎng)時(shí)程突觸可塑性

3、形成和突觸重構(gòu)密切相關(guān)。近年許多研究均發(fā)現(xiàn)長(zhǎng)時(shí)間癇性活動(dòng)發(fā)作后，COX-2在腦內(nèi)迅速被誘導(dǎo)激活，在大腦皮層、海馬、杏仁核等處廣泛表達(dá)。許多研究表明COX-2抑制劑能明顯對(duì)抗戊四氮誘導(dǎo)的驚厥發(fā)作，且在電休克誘導(dǎo)的驚厥模型中，苯妥因聯(lián)合COX-2抑制劑能增強(qiáng)其抗驚厥作用。目前有關(guān)COX-2在癲癇是否參與了顳葉癲癇海馬環(huán)路內(nèi)突觸重建，從而促進(jìn)了顳葉癲癇的形成與發(fā)展尚不清楚，且其抑制劑抗驚厥的作用機(jī)制國(guó)內(nèi)外均未見(jiàn)有進(jìn)一步深入的研究。本研究旨在研

4、究COX-2在癇性發(fā)作活化后的表達(dá)特點(diǎn)，看COX-2抑制劑是否能通過(guò)抑制COX-2的活性來(lái)糾正癇性活動(dòng)引起腦內(nèi)微環(huán)境改變所致的海馬異常突觸重構(gòu)，從而減少慢性期自發(fā)性反復(fù)性癇性發(fā)作(SRS)的發(fā)生，研究其在癇性發(fā)作后突觸重構(gòu)密切相關(guān)的異常神經(jīng)發(fā)生及膠質(zhì)細(xì)胞活化和增生等事件中的作用及發(fā)揮作用的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。COX-2抑制劑對(duì)癇性發(fā)作后海馬結(jié)構(gòu)和功能改變這種長(zhǎng)時(shí)程事件的影響是通過(guò)對(duì)神經(jīng)元突觸電活動(dòng)的影響而實(shí)現(xiàn)的，可能和影響神經(jīng)遞質(zhì)釋放及改

5、變離子通道通透性等有關(guān)。而Na+離子通道是許多抗癲癇藥物的治療靶點(diǎn)。我們通過(guò)建立體外海馬腦組織切片癇樣放電模型，向腦片灌流液中加入COX-2抑制劑，觀察其對(duì)海馬CA1椎體神經(jīng)元膜興奮特性、鈉離子通道及突觸活動(dòng)的影響，從多角度、多層次來(lái)研究COX-2及其抑制劑在幼鼠癇性發(fā)作中的作用及其機(jī)制，看能否提供新的控制癲癇發(fā)作的治療策略和預(yù)防靶點(diǎn)。 方法： 1.體內(nèi)部分實(shí)驗(yàn)： 模型制作：隨機(jī)將120只體重為50～60g的3周

6、齡健康Wistar幼鼠分為匹魯卡品致癇組(EP-Only組)(n=45)和塞萊昔布干預(yù)致癇組(EP-Celecoxib)(n=45)和生理鹽水正常對(duì)照組(NS組)(n=30)3組。匹魯卡品癲癇模型的建立：腹腔注射10％匹魯卡品350 mg/kg，若注射匹魯卡品后30min無(wú)驚厥發(fā)作，再按每次10mg/kg追加匹魯卡品，若驚厥發(fā)作持續(xù)30min(定為癲癇持續(xù)狀態(tài)的標(biāo)準(zhǔn))仍未停止，則給予10％水合氯醛400mg/kg腹腔注射，及時(shí)終止發(fā)作。

7、EP-Celecoxib組大鼠在注射東莨宕堿前45min預(yù)先通過(guò)胃管灌入20mg/kg.d的塞萊昔布，腹腔注射完匹魯卡品后每天均按此劑量灌胃，直至動(dòng)物被處死。隨機(jī)在EP-only及EP-Celeeoxib組各取10只匹魯卡品成功誘導(dǎo)急性發(fā)作幼鼠進(jìn)行腹腔注射BrdU，劑量100mg/kg，從急性發(fā)作當(dāng)天開始，隔天注射一次，直到發(fā)作后第14天。 (1)動(dòng)物行為學(xué)觀察：根據(jù)Racine分級(jí)評(píng)價(jià)癇性發(fā)作行為。觀察急性期癲癇幼鼠癇性發(fā)作行

8、為在各組的差異，監(jiān)測(cè)慢性期(急性發(fā)作后28～42天)自發(fā)性反復(fù)性發(fā)作(SRS)的發(fā)生率及發(fā)作強(qiáng)度在各組的差異。 (2)形態(tài)學(xué)檢測(cè)：各試驗(yàn)組分別在急性發(fā)作后第14天，28天處死大鼠制備組織切片。①Nissl染色：檢測(cè)海馬神經(jīng)元損傷及丟失情況；②免疫組織化學(xué)方法：檢測(cè)指標(biāo)有COX-2、C-fos及p-ERK1/2陽(yáng)性細(xì)胞在各組的表達(dá)變化趨勢(shì)，OX-42標(biāo)記少突膠質(zhì)細(xì)胞的活化，比較小膠質(zhì)細(xì)胞的活化在各組的差異；BrdU標(biāo)記增殖的新生細(xì)

9、胞，NeuN為特異性神經(jīng)元標(biāo)志，GFAP為星型膠質(zhì)細(xì)胞特異性標(biāo)志，BrdU+NeuN熒光免疫雙標(biāo)標(biāo)記癇性發(fā)作后新生神經(jīng)元，BrdU+GFAP免疫雙標(biāo)標(biāo)記增生的星型膠質(zhì)細(xì)胞，觀察神經(jīng)前體細(xì)胞的增殖及分化在各組的差異； (3)western blot方法：檢測(cè)COX-2、C-fos、ERK1、ERK2及磷酸化ERK1/2(p-ERK1/2)蛋白水平在癇性發(fā)作后1h、1d、4d、7d、14d、28d各時(shí)點(diǎn)的表達(dá)及變化趨勢(shì)，比較在匹魯卡品誘導(dǎo)S

10、E后的靜止期其表達(dá)水平在各組的表達(dá)是否有差異，探討COX-2及其抑制劑發(fā)揮作用的細(xì)胞信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑。 2.體外試驗(yàn)部分： 離體海馬腦片癇樣放電模型的建立：生后14天齡SD大鼠，快速斷頭取腦后用振動(dòng)切片機(jī)切成400μm海馬組織腦切片，用電刺激誘發(fā)CA1區(qū)錐體神經(jīng)元記錄場(chǎng)電位，以群峰電位(PS)個(gè)數(shù)和幅度的變化來(lái)評(píng)價(jià)腦片放電的變化，灌流不同濃度青霉素，觀察到藥物作用約3min后PS個(gè)數(shù)增多和幅度增加，有明顯的癲癇樣放電，建立離

11、體海馬腦片癇樣放電模型，從以下幾方面來(lái)觀察COX-2抑制劑NS-398對(duì)癇性放電后海馬錐體神經(jīng)元電生理特性的影響： (1)COX-2抑制劑NS-398對(duì)青霉素致癇腦片CA1場(chǎng)電位的影響：腦片灌流液中灌流不同濃度NS-398，觀察對(duì)PS個(gè)數(shù)和幅度的影響； (2)腦片全細(xì)胞記錄技術(shù)研究NS-398對(duì)青霉素致癇幼鼠海馬腦片CA1區(qū)錐體神經(jīng)膜興奮特性的影響，分析對(duì)動(dòng)作電位幅度、頻率、潛伏期和時(shí)程的影響； (3)通過(guò)給予不

12、同階躍模式的電壓刺激，觀察NS-398對(duì)電壓依賴性鈉離子通的影響，分別研究對(duì)其激活曲線和失活曲線的影響； (4)全細(xì)胞記錄Gap-free模式下，觀察NS-398對(duì)海馬CA1錐體神經(jīng)元遞質(zhì)釋放和突觸活動(dòng)的影響，分別記錄自發(fā)性興奮性突觸后電流(sEPSCs)和自發(fā)性抑制性突觸后電流(sIPSCs)，觀察NS-398對(duì)其幅度和頻率的影響。 結(jié)論： 1.COX-2在癇性發(fā)作后被迅速誘導(dǎo)表達(dá)，COX-2抑制劑能抑制癇性發(fā)

13、作及發(fā)作后COX-2的活化； 2.COX-2抑制劑能減少癇性發(fā)作后海馬神經(jīng)元的死亡，抑制小膠質(zhì)細(xì)胞的活化，抑制癇性發(fā)作激活的異常神經(jīng)發(fā)生和星型膠質(zhì)細(xì)胞增生，糾正癇性發(fā)作后海馬異?？伤苄缘陌l(fā)生，從而減少慢性期SRS的發(fā)生； 3.COX-2抑制劑逆轉(zhuǎn)海馬異?？伤苄缘陌l(fā)生是通過(guò)抑制癇性發(fā)作激活的MAPK/ERK信號(hào)轉(zhuǎn)導(dǎo)途徑及其下游信號(hào)分子C-fos而發(fā)揮效應(yīng)； 4.COX-2抑制劑能延長(zhǎng)海馬錐體神經(jīng)元鈉離子通道失活時(shí)間