COX-2抑制劑在腫瘤細(xì)胞增殖及放射增敏中作用的研究.pdf

1、目的：研究COX-2抑制劑對(duì)不同COX-2表達(dá)水平腫瘤細(xì)胞的增殖、放射敏感性的影響,初步探討其可能作用機(jī)制;建立利用小干擾RNA(small interfering RNA,siRNA)抑制COX-2表達(dá)的HeLa細(xì)胞模型,以此探討單一抑制COX-2途徑對(duì)腫瘤細(xì)胞的影響。
　　方法：體外培養(yǎng)人宮頸癌HeLa細(xì)胞和人結(jié)腸癌SW480細(xì)胞,實(shí)驗(yàn)分為3個(gè)部分。第一部分:以western blot法檢測2株細(xì)胞COX-2蛋白的表達(dá)水平;以

2、MTT法檢測塞來昔布對(duì)2株細(xì)胞生長增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測塞來昔布對(duì)細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期的影響。第二部分:實(shí)驗(yàn)分4組:對(duì)照組、單純給塞來昔布組、單純照射組、塞來昔布聯(lián)合照射組,以適當(dāng)濃度塞來昔布作用48h后X線照射,細(xì)胞克隆集落形成法測定HeLa細(xì)胞和SW480細(xì)胞的放射增敏效果;流式細(xì)胞儀檢測照射后細(xì)胞凋亡率和細(xì)胞周期的分布;應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測Ku70、Ku80 mRNA和蛋白的表達(dá)變化。第三部分:構(gòu)建靶向

3、抑制COX-2的siRNA表達(dá)質(zhì)粒,轉(zhuǎn)染HeLa細(xì)胞,篩選穩(wěn)定表達(dá)的轉(zhuǎn)化克隆,Western blot檢測COX-2表達(dá)變化;克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測siRNA抑制COX-2表達(dá)后對(duì)宮頸癌HeLa細(xì)胞增殖的影響;流式細(xì)胞術(shù)檢測細(xì)胞凋亡和細(xì)胞周期;細(xì)胞克隆集落形成法測定細(xì)胞放射增敏效果;應(yīng)用RT-PCR和Western blot檢測siRNA抑制COX-2表達(dá)后對(duì)HeLa細(xì)胞Ku70、Ku80表達(dá)的改變。
　　結(jié)果：第一部分:(1)HeLa

4、細(xì)胞結(jié)構(gòu)性表達(dá)COX-2蛋白,而SW480細(xì)胞無明顯COX-2蛋白表達(dá);(2)MTT顯示塞來昔布作用48h對(duì)HeLa細(xì)胞、SW480細(xì)胞的增殖均產(chǎn)生明顯抑制,對(duì)SW480細(xì)胞的增殖抑制作用較HeLa細(xì)胞更為明顯(40mmol/L塞來昔布時(shí),t=3.48, P=0.0024);(3)流式細(xì)胞儀檢測結(jié)果顯示較低濃度塞來昔布對(duì)2株細(xì)胞沒有誘發(fā)明顯的細(xì)胞凋亡,但均可引起G0/G1期的細(xì)胞周期阻滯并減少S期,對(duì)HeLa細(xì)胞還有G2/M期的細(xì)胞的減

5、少,對(duì)SW480細(xì)胞G2/M期的細(xì)胞百分比沒有變化;第二部分:(1)HeLa細(xì)胞和SW480細(xì)胞塞來昔布聯(lián)合照射組的D0、SF2均明顯低于單純照射組,在 D0劑量時(shí)的放射增敏比(SER)分別為1.357和1.11X;(2)線照射后24h,HeLa細(xì)胞、SW480細(xì)胞均有明顯的G2/M期阻滯和細(xì)胞凋亡,塞來昔布聯(lián)合照射組的細(xì)胞凋亡率明顯高于單純照射組;celecoxib可減弱照射引起的 HeLa細(xì)胞G2/M期阻滯,卻放大SW480細(xì)胞的G

6、2/M期阻滯;(3)RT-PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示,單純?nèi)麃砦舨甲饔每梢允笻eLa細(xì)胞、SW480細(xì)胞的Ku70、Ku80表達(dá)降低,X線可誘發(fā) Ku70、Ku80表達(dá)增高;塞來昔布聯(lián)合照射組細(xì)胞的Ku70、Ku80表達(dá)明顯低于單純照射組。第三部分:(1)獲得穩(wěn)定表達(dá) SiRNA的轉(zhuǎn)化細(xì)胞株( HeLa/COX-2i) COX-2蛋白表達(dá)明顯受抑制,而轉(zhuǎn)入陰性對(duì)照質(zhì)粒的細(xì)胞株( HeLa/Negi) COX-2蛋白表達(dá)

7、不受影響;(2) HeLa/COX-2i細(xì)胞的克隆形成率(0.46±0.04)顯著低于HeLa細(xì)胞(0.84±0.03)(t=4.3, P=0.008);(3)HeLa,HeLa/Negi, HeLa/COX-2i三株細(xì)胞的細(xì)胞周期分布以及細(xì)胞凋亡率無顯著差異,接受放射后三株細(xì)胞較放射前均發(fā)生一定程度的G2/M期阻滯;(4)HeLa/COX-2i細(xì)胞株的D0、SF2較HeLa細(xì)胞無明顯變化,其增敏比為1.008;(5)RT-PCR及We

8、stern blot顯示RNAi抑制COX-2表達(dá)后Ku70,Ku80在轉(zhuǎn)錄和翻譯水平均受抑制,但對(duì)放射誘導(dǎo)表達(dá)增高的Ku70,Ku80沒有下調(diào)作用。
　　結(jié)論：選擇性COX-2抑制劑塞來昔布對(duì)不同COX-2表達(dá)水平的HeLa細(xì)胞和SW480細(xì)胞均有生長抑制作用和放射增敏作用,以SiRNA技術(shù)單純抑制COX-2表達(dá),可以抑制細(xì)胞生長,但不能改變細(xì)胞放射敏感性,說明塞來昔布對(duì)細(xì)胞生長抑制和放射增敏作用機(jī)制存在非COX-2依賴途徑。塞