褪黑素對(duì)馬桑內(nèi)酯致癇大鼠海馬內(nèi)SP及SPR水平的影響.pdf

1、癲癇(Epilepsy)是中樞神經(jīng)系統(tǒng)的常見病和多發(fā)病，是中樞神經(jīng)元反復(fù)陣發(fā)性過度放電的結(jié)果。癲癇患者腦內(nèi)興奮性系統(tǒng)與抑制性系統(tǒng)失去平衡是癲癇發(fā)作的主要神經(jīng)機(jī)制。褪黑素（melatonin，MT）是一種主要由丘腦松果體細(xì)胞合成、分泌的吲哚類神經(jīng)內(nèi)分泌激素。研究表明，MT能通過細(xì)胞膜上的特異性的MT受體發(fā)揮其抗癲癇作用，海馬及其亞區(qū)域內(nèi)GABA神經(jīng)元也能表達(dá)MT受體，這樣MT能通過增強(qiáng)GABA及其受體活性，抑制或減弱癲癇的發(fā)作，保護(hù)腦神經(jīng)

2、。而MT膜受體競(jìng)爭(zhēng)性拮抗劑Luzindole能夠阻斷MT的抗驚厥作用、抑制癲癇發(fā)作的作用。P物質(zhì)（Substance P，SP）屬于速激肽家族，能參與癲癇的發(fā)作。大量研究發(fā)現(xiàn)P物質(zhì)能與抑制性神經(jīng)遞質(zhì)GABA共存于海馬主要神經(jīng)元。以上這些提醒我們MT的抑癇過程中可能會(huì)對(duì)SP\SPR產(chǎn)生影響。但是目前MT的抗癇作用機(jī)制尚未完全闡明。 為進(jìn)一步研究MT的抑癇作用，本研究在馬桑內(nèi)酯致癇的癲癇大鼠模型基礎(chǔ)上，采用免疫細(xì)胞化學(xué)和RT－PCR方

3、法，從細(xì)胞和基因水平觀察了MT對(duì)癲癇大鼠海馬內(nèi)SP及SPR水平的變化，以進(jìn)一步探討MT的抑癇作用機(jī)制。 首先，免疫組化用40只健康SD雄性大鼠，隨機(jī)分為四組，每組10只，分別為A組：生理鹽水對(duì)照組；B組：馬桑內(nèi)酯致癇組；C組：褪黑素＋馬桑內(nèi)酯組；D組：Luzindole＋褪黑素＋馬桑內(nèi)酯組。參照Smialowaki的評(píng)論標(biāo)準(zhǔn)分級(jí)，觀察記錄大鼠行為學(xué)表現(xiàn)，用免疫組化方法（SABC法）檢測(cè)海馬內(nèi)SP及SPR含量的變化，最后再用20只

4、健康SD雄性大鼠（每組5只，動(dòng)物模型及分組與免疫組化相同），采用SYBR Green 1熒光PCR方法，對(duì)各組大鼠海馬內(nèi)SP mRNA進(jìn)行相對(duì)定量后，在基因水平比較MT對(duì)SP mRNA表達(dá)的影響。結(jié)果顯示，行為學(xué)表現(xiàn)上：A組幾乎無癲癇發(fā)作的表現(xiàn)和癇樣放電，B組D組幾乎都有癲癇發(fā)作且發(fā)作程度極強(qiáng)（Ⅳ－Ⅴ級(jí)），發(fā)作持續(xù)時(shí)間長(zhǎng)。而A、C組大鼠幾乎無癲癇發(fā)作或僅有輕微發(fā)作表現(xiàn)；免疫化學(xué)觀察：各組大鼠海馬CA1－CA3區(qū)錐體細(xì)胞層和DG顆粒細(xì)胞層

5、神經(jīng)元中均有SP與SPR免疫陽(yáng)性表達(dá)。在高倍光鏡下，SP陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)于神經(jīng)元胞體的胞漿中，胞核空染。在高倍鏡下，SPR陽(yáng)性細(xì)胞表達(dá)于神經(jīng)元細(xì)胞胞體的胞漿及軸突中，胞核空染。還可見較長(zhǎng)神經(jīng)纖維深染。檢測(cè)SP的各組之間比較：B組（CL組）、D組（LU組）SP的免疫反應(yīng)明顯強(qiáng)于A組（對(duì)照組）（P＜0.05），C組與B組、D組相比SP陽(yáng)性細(xì)胞免疫明顯減弱，陽(yáng)性細(xì)胞著色變淺，數(shù)目減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果P＜0.05，認(rèn)為有明顯差別。C組與對(duì)照相比沒有明顯

6、差別（P＞0.05）。檢測(cè)SPR的各組之間比較：B組（CL組）、D組（LU組）SP的免疫反應(yīng)明顯強(qiáng)于A組（對(duì)照組）（P＜0.05），C組與B組、D組相比SP陽(yáng)性細(xì)胞免疫明顯減弱，陽(yáng)性細(xì)胞著色變淺，數(shù)目減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果P＜0.05，認(rèn)為有明顯差別。C組與對(duì)照相比沒有明顯差別（P＞0.05）。實(shí)時(shí)熒光定量PCR采用2－△△CT法計(jì)算各組SP基因表達(dá)的差異，B組或D組大鼠與A組相比，海馬內(nèi)SP mRNA明顯升高，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果P＜0.05。C組大

7、鼠與B組或D組相比，海馬內(nèi)SP mRNA相對(duì)含量明顯減少，統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果P＜0.05。C組大鼠與生理鹽水對(duì)照組比幾乎無差別統(tǒng)計(jì)學(xué)結(jié)果P>0.05。本實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，CL致癇組大鼠海馬內(nèi)SP/SPR含量明顯升高，SP/SPR確實(shí)參與癲癇發(fā)作。在使用褪黑素預(yù)處理大鼠后，大鼠在癲癇發(fā)作嚴(yán)重程減弱，癲癇發(fā)作的耐受性明顯增強(qiáng)。免疫組化所示：褪黑素預(yù)處理的大鼠海馬內(nèi)，SP免疫反應(yīng)明顯減弱。基因水平的檢測(cè)顯示：褪黑素能減少癲癇大鼠腦內(nèi)SP mRNA的量。行

8、為學(xué)表現(xiàn)、形態(tài)學(xué)表現(xiàn)、基因水平的檢測(cè)結(jié)果都互相吻合。而先用MT受體拮抗劑Luuzindole預(yù)處理的大鼠癲癇發(fā)作再次增強(qiáng)，海馬內(nèi)SP/SPR表達(dá)比C組大鼠明顯增強(qiáng)，說明MT是通過其特異性受體發(fā)揮抑癇作用的。因此我們認(rèn)為，褪黑素的抑制癲癇作用機(jī)制中，確實(shí)有對(duì)SP及SRR的參與。MT可能通過與特異性的G蛋白膜受體結(jié)合后，調(diào)節(jié)大鼠海馬內(nèi)SP及SRR的含量及活性來抑制癲癇發(fā)作。 綜上所述，MT對(duì)馬桑內(nèi)酯致癇大鼠有明顯的抑制作用，可能通過