葡萄果實查耳酮合成酶研究——基因克隆、表達、純化、抗體的制備以及UV、糖對葡萄果實查耳酮合成酶的調(diào)節(jié).pdf

1、查耳酮合成酶(CHS，E.C.23.1.74)是植物類黃酮代謝途徑的入口酶，也是此途徑的第一個關(guān)鍵限制酶，它參與了以C<,15>為基本骨架的類黃酮物質(zhì)的形成，它在研究植物類黃酮代謝途徑調(diào)控機制具有十分關(guān)鍵的作用。本文通過構(gòu)建chs原核表達載體進行原核表達，分離純化得到高純度的CHS蛋白。通過免疫兔子制備多克隆抗體，并對血清進行了分離純化，得到了葡萄中CHS特異性多克隆抗體?？贵w在葡萄不同組織部位均檢測到一條43 kD的蛋白條帶。并在此基

2、礎(chǔ)上探討了查耳酮合成酶在葡萄果實的亞細胞定位以及UV、蔗糖處理對葡萄果實CHS的調(diào)控機制，為進一步研究葡萄果實中查耳酮合成酶在類黃酮代謝途徑中的生理功能奠定了良好的實驗和理論基礎(chǔ)。 采用聚合酶鏈式反應(yīng)(polymerase chain reaction，PCR)對葡萄chs基因全序列進行擴增，擴增產(chǎn)物直接連接到克隆載體pMD18-T，并轉(zhuǎn)化大腸桿菌DH5α。經(jīng)過藍白斑篩選、小量提取質(zhì)粒進行酶切鑒定以及基因測序鑒定得到chs全長基

3、因，命名為pMK-chs。 通過使用限制性內(nèi)切酶(EcRⅠ和Sal Ⅰ)將質(zhì)粒pMD-chs進行雙酶切，得到帶有雙酶切粘性末端的chs基因片斷，同樣方法處理表達載體pET-30a(+)。兩基因片段純化后用T<,4>DNA連接酶進行定向連接，得到重組質(zhì)粒，命名為pET

4、驗證，得到純化的CHS蛋白。 以純化的CHS蛋白為抗原，免疫純種新西蘭白兔，制備CHS多克隆抗體。依次經(jīng)過(NH<,4>)<,2>SO<,4>分級沉淀、DEAE-Sepharose FF離子交換層析純化，得到抗體lgG。純化后的抗體通過酶聯(lián)免疫、蛋白質(zhì)斑點雜交和Western blot分析，表明具有良好的效價和較高的靈敏度與特異性。葡萄果實不同組織部位和果實發(fā)育過程中的CHS的蛋白質(zhì)免疫印跡分析表明，抗體均能特異性地檢測到一條4

5、31 kD的蛋白條帶。在葡萄果實發(fā)育過程中，幼果期CHS蛋白含量很低，進入轉(zhuǎn)色期開始大量增加，這種狀態(tài)一直持續(xù)到果實成熟采收。 以盛花后70 d的赤霞珠(Vitis viniferα.L.cv.Cabernet Sauvienon)果實為試材，應(yīng)用紫外線(UV)照射技術(shù)，研究了UV照射對葡萄果實類黃酮代謝產(chǎn)物的影響。同時應(yīng)用膠體金免疫電子顯微鏡操作技術(shù)首次對CHS在葡萄果實(果皮和果肉)內(nèi)進行了亞細胞定位。結(jié)果表明UV誘導(dǎo)了果實

6、類黃酮代謝產(chǎn)物(總酚、總類黃酮、總花色苷)的大量合成，類黃酮代謝入口酶一查耳酮合成酶轉(zhuǎn)錄水平和蛋白含量明顯增加。膠體金免疫電鏡顯示，CHS主要存在于葡萄果實細胞的質(zhì)體(葉綠體、有色體)、細胞質(zhì)、次生壁、粗糙內(nèi)質(zhì)網(wǎng)，在細胞壁和液泡中含量分布較少。 以幼果期(20 d)和轉(zhuǎn)色期(70 d)赤霞珠葡萄果實為試材，應(yīng)用糖(蔗糖、葡萄糖、果糖)滲透完整果實的實驗體系，研究了糖處理對葡萄果實類黃酮代謝的影響。結(jié)果表明，外施蔗糖處理促進了葡萄