銀杏時黃酮積累相關基因克隆及查爾酮合成酶基因啟動子功能研究.pdf

1、為了深入研究銀杏葉黃酮合成的分子機理,為今后利用生物技術手段提高銀杏黃酮含量奠定基礎,本文從銀杏中克隆并研究了與黃酮積累相關的幾個酶基因:查爾酮異構酶(GbCHI),類黃酮3'-羥化酶(F3'H),烯醇式丙酮基莽草酸3磷酸合成酶(EPSP),肉桂酰輔酶A還原酶(CCR)及查爾酮合成酶基因啟動子(CHSP)序列。主要研究內容及結果如下:
　　 (1)銀杏查爾酮異構酶基因(GbCHI)的克隆、性質及表達模式的研究。利用簡并PCR和R

2、ACE技術從銀杏葉片中克隆得到GbCHI的cDNA序列和基因組全長。通過信息學分析發(fā)現(xiàn),基因組GbCHI含有兩個內含子三個外顯子,GbCHI cDNA全長為926bp,含有一個735bp的開放式閱讀框(OPF),編碼244個氨基酸序列,預測分子量為26.29kDa,等電點為7.76。蛋白質同源序列分析表明,GbCHI與TypeⅠ型CHI同源性較高。CHIs蛋白序列進化樹分析結果顯示GbCHI未聚合到兩類中,且分化時間早于TypeⅠ和Ty

3、peⅡ型CHI。Southern blot分析表明,GbCHI屬于多基因家族;GbCHI重組蛋白大腸桿菌表達顯示,其蛋白大小與cDNA序列預測蛋白大小一致,親和層析及Western blot分析顯示,重組GbCHI且含有6xHis標簽,GbCHI能在大腸桿菌中正常表達;重組GbCHI酶活性分析表明,GbCHI具有TypeⅠ型CHI的酶催化特點,即催化6'-羥基查爾酮生成(2S)-黃烷酮;RT-PCR分析顯示,GbCHI基因在銀杏不同組織

4、中都有表達,但存在較大差異,只有成熟葉和雄蕊中表達量最高。CHI與銀杏葉黃酮含量的年周期變化分析顯示,CHI基因的轉錄水平與CHI的酶活性呈線性相關,相關系數(shù)為0.421;酶活性與黃酮的年周期變化之間也呈線性相關,相關系數(shù)為0.373。激素和脅迫誘導表達分析顯示,雖然誘導表達模式不盡相同,但GbCHI轉錄水平能被UV-B、CCC、ABA、ALA和ETH誘導上調,而被GA抑制表達;GbCHI誘導表達模式與銀杏葉黃酮的調控變化相一致,暗示G

5、bCHI在銀杏黃酮代謝過程中具有關鍵酶作用。
　　 (2)銀杏類黃酮3'-羥化酶基因(GbF3'H)的克隆、性質及表達模式研究。利用簡并PCR和RACE技術從銀杏葉片中克隆得到了GbF3'H的cDNA全長序列。通過信息學分析發(fā)現(xiàn)GbF3'H的cDNA全長為2144 bp,含有一個1671 bp的開放式閱讀框(ORF),編碼556個氨基酸序列。蛋白質同源序列分析表明,GbF3'H與其他物種F3'H同源性較低,而與菊苣(Cichor

6、ium intybus)同源性最高,為56.3％。同源建模分析顯示GbF3'H與P450家族蛋白的三維結構及活性位點高度相似,最終定位于微粒體膜上。F3'Hs蛋白序列進化樹分析結果顯示GbF3'H與其他植物分化較早。Southernblot分析表明,GbF3'H屬于多基因家族。GbF3'H重組蛋白大腸桿菌表達顯示,其蛋白大小與cDNA序列預測蛋白大小基本一致,親和層析及Western blot分析顯示,重組GbF3'H含有6xHis標簽

7、,GbF3'H能在大腸桿菌中正常表達。RT-PCR分析顯示,GbF3'H基因在銀杏不同組織中都有表達,其中雄蕊表達水平最高,其次為成熟葉。激素和脅迫誘導表達分析顯示,雖然誘導表達模式不相同,但GbF3'H轉錄水平能被UV-B、6-BA、SA、ABA和IAA誘導上調,而傷害處理對其表達量無明顯改變。GbF3'H誘導表達模式與銀杏ANS基因的表達模式相似,而且其上游調控序列也發(fā)現(xiàn)有相關的調節(jié)單元,意味著該GbF3'H基因可能參與了銀杏花色素

8、的合成代謝。
　　 (3)銀杏烯醇式丙酮基莽草酸3磷酸合成酶(EPSPs)的克隆、性質及表達模式研究。利用簡并PCR和RACE技術從銀杏葉中克隆到EPSP合酶基因(GbEPSPs)的cDNA全長序列。信息學分析發(fā)現(xiàn),GbEPSP的cDNA全長1403 bp,包含最大閱讀框(ORF)為1035 bp,編碼一個344氨基酸多肽序列。蛋白質同源序列分析表明,銀杏EPSP合酶蛋白質序列與其他物種的EPSP合酶同源性較高,在81％-84％

9、之間。進化樹分析結果表明,在參試物種中GbEPSPs作為裸子植物與被子植物同聚為一類,但分歧時間相對更早。Southern blot分析表明,EPSPs基因有多個拷貝,屬于一個小的多基因家族。不同組織表達分析顯示,EPSPs基因在銀杏的葉和果中表達量最高,其次為莖,根中表達水平最低。草甘膦處理能顯著誘導銀杏EPSPs基因表達量升高,紫外能上調銀杏EPSPs基因表達,ABA則誘導GbEPSPs表達量先升后降;溫度對GbEPSPs具有不同的

10、誘導作用,其中42℃高溫誘導最顯著4 h達最大值,后又迅速降低。暗示銀杏葉片中EPSPs基因在環(huán)境壓力下表達量升高有可能與芳香族氨基酸向黃酮類物質的轉化有關。
　　 (4)銀杏肉桂酰輔酶A還原酶基因(GbCCR)的克隆、性質及表達模式研究。利用簡并PCR和RACE技術從銀杏葉片中克隆得到了GbCCR的cDNA全長序列。信息學分析發(fā)現(xiàn),GbCCR的cDNA全長為1178 bp,含有一個972 bp的開放式閱讀框(ORF),編碼32

11、3個氨基酸序列。蛋白質同源序列分析表明,GbCCR與其他物種CCR同源性相對較高,與挪威云杉(Picea abies)同源性最高,為68.6％;同源建模分析顯示GbCCR序列與其他家族蛋白的三維結構及活性位點高度相似。CCRs蛋白序列進化樹分析結果顯示GbCCR與其他植物分化較早。SouSern blot分析表明,GbCCR屬于多基因家族;GbCCR重組蛋白大腸桿菌表達顯示,其蛋白大小與cDNA序列預測融合蛋白大小基本一致,親和層析及W

12、estern blot分析顯示,重組GbCCR含有6xHis標簽,GbCCR能在大腸桿菌中正常表達;RT-PCR分析顯示,GbCCR基因在銀杏不同組織中都有表達,但與其他黃酮類代謝基因表達差異較大,其中莖和根中表達水平最高,其次為成熟葉。GA和農桿菌誘導表達分析顯示,雖然二者都能誘導基因表達,但GA能夠明顯誘導GbCCR轉錄水平上調,而農桿菌侵染處理對其表達量無明顯改變。GbCCR誘導表達模式顯示,該基因可能主要參與組織及細胞壁中木質素

13、的合成,而與抗病蟲害無明顯關系。
　　 (5)銀杏查爾酮合成酶基因啟動子(GbCHSF)的調控元件及功能分析。通過染色體步移方法從銀杏基因組中克隆到查爾酮合成酶基因(GbCHS)翻譯起始位點上游1711bp的啟動子序列。生物信息學分析表明,該啟動子片段中存在多個順式作用元件,包括紫外/藍光響應單元、植物激素響應單元、真菌誘導元件、MYB結合位點、TATA-box和CAAT-box等。亞克隆了GbCHS轉錄起始位點上游1402 b