青蒿萜類合成酶基因及啟動(dòng)子的克隆與功能分析.pdf

1、萜類化合物以異戊二烯（C5）為結(jié)構(gòu)單元構(gòu)成了植物界中最大的天然化合物家族，是植物次生代謝物中重要的組成部分。植物通過次生代謝合成多種萜類化合物以防御各類生物和非生物脅迫。萜類還具有重要經(jīng)濟(jì)價(jià)值，可用作香精香料、藥物以及殺蟲劑等等。萜類合成酶通常是催化萜類化合物合成途徑的第一個(gè)關(guān)鍵酶，其基因表達(dá)受到轉(zhuǎn)錄因子、激素、逆境等多種因素的調(diào)控，進(jìn)而構(gòu)成了復(fù)雜的次生代謝網(wǎng)絡(luò)。
　　青蒿（Artemisia annua L.）是一年生草本植物，

2、其次生代謝產(chǎn)物中的青蒿素是重要的抗瘧疾藥物。同時(shí)，青蒿精油中還富含功能各異的單萜和倍半萜，例如1,8-桉葉醇，石竹烯，青蒿酮等等。青蒿素合成途徑中的ADS、CYP71AV1、DBR2、ALDH1等關(guān)鍵結(jié)構(gòu)酶基因已被發(fā)現(xiàn)，然而還存在較多其他的萜類合成酶基因有待克隆和鑒定，以加深對(duì)萜類化合物功能和結(jié)構(gòu)的了解。
　　本研究從青蒿腺毛轉(zhuǎn)錄組文庫(kù)中克隆得到兩條萜類合成酶基因AaTPS7和AaTPS8。生物信息學(xué)分析結(jié)果顯示AaTPS7全長(zhǎng)1

3、863 bp，編碼含620個(gè)氨基酸的蛋白，與青蒿中幾種單萜合酶有較高的同源性。AaTPS8全長(zhǎng)1683 bp，編碼含560個(gè)氨基酸的蛋白，與菊科不同植物的大根香葉烯A合酶同源性較高。體外酶催化實(shí)驗(yàn)表明AaTPS8是一種倍半萜合酶，能催化FPP生成三種產(chǎn)物，主產(chǎn)物為臭根醇。雖然GC-MS沒有檢測(cè)到AaTPS7催化FPP或GPP生成的產(chǎn)物，但經(jīng)過多重序列比對(duì)和進(jìn)化分析后，推測(cè)其為單萜合酶。實(shí)時(shí)熒光定量PCR結(jié)果顯示AaTPS7和 AaTPS

4、8在青蒿不同組織和不同部位葉片中不同程度表達(dá)，在幼嫩的葉片，莖或花蕾中的表達(dá)量相對(duì)較高。
　　運(yùn)用基因組步移法克隆了AaTPS7和AaTPS8的啟動(dòng)子區(qū)域，長(zhǎng)度分別為1167 bp和1629 bp。生物信息學(xué)分析發(fā)現(xiàn)了啟動(dòng)子中存在多個(gè)順式調(diào)控元件，例如WRKY類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)W-box和MYB類轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)MBS，以及響應(yīng)MeJA的CGTCA-motif和響應(yīng)ABA的ABRE元件，推測(cè)兩個(gè)啟動(dòng)子可能受到轉(zhuǎn)錄因子、機(jī)械損傷等多

5、種因素的調(diào)控。構(gòu)建啟動(dòng)子與 GUS基因的融合載體并轉(zhuǎn)化青蒿，GUS染色結(jié)果表明這兩個(gè)啟動(dòng)子驅(qū)動(dòng)基因在非分泌型腺毛中的特異表達(dá)，而在分泌型腺毛中完全沒有染色。由于青蒿素的合成和儲(chǔ)存都發(fā)生在分泌型腺毛，因而推測(cè)AaTPS7和AaTPS8與青蒿素的合成關(guān)聯(lián)較小。對(duì)轉(zhuǎn)基因青蒿噴灑MeJA和ABA，3小時(shí)后GUS基因表達(dá)水平有所上調(diào)，說明proTPS7和proTPS8能受到兩種激素的誘導(dǎo)。組成型啟動(dòng)子普遍應(yīng)用于基因工程研究，但仍存在許多不足。腺毛