紅蓋鱗毛蕨查爾酮合成酶基因的克隆與功能分析.pdf

1、紅蓋鱗毛蕨(Dryopteriserythrosora(Eaton)O.Ktze)是藥用蕨類(lèi)植物，含有豐富的黃酮類(lèi)化合物，具有抗病毒、抗腫瘤、抗菌消炎等功能。目前對(duì)于紅蓋鱗毛蕨黃酮類(lèi)化合物的研究集中在含量的測(cè)定和種類(lèi)分析上，對(duì)于影響黃酮含量和形成的內(nèi)外因素尚無(wú)系統(tǒng)的研究。在自然條件下，季節(jié)變化對(duì)黃酮含量有明顯的影響，然而此方面的研究尚無(wú)報(bào)道。有關(guān)蕨類(lèi)植物中黃酮類(lèi)化合物生物合成途徑已經(jīng)起步，目前已經(jīng)在蕨類(lèi)中克隆到查爾酮合成酶(chalco

2、nesynthase，CHS)基因，但仍沒(méi)有對(duì)其功能的分析。
　　基于以上的背景，本研究獲得以下兩方面的結(jié)果。
　　1.對(duì)紅蓋鱗毛蕨的羽片、葉軸、根和莖（根莖）的總黃酮含量和抗氧化活性進(jìn)行季節(jié)動(dòng)態(tài)分析。紅蓋鱗毛蕨各部位總黃酮含量均表現(xiàn)出明顯的季節(jié)動(dòng)態(tài)變化。羽片中平均黃酮含量只有2.01％，最低含量為0.78％，而莖中黃酮含量為4.3％-12.5％，明顯高于羽片中黃酮含量。在春季，莖中黃酮含量相對(duì)較低，但是在夏季含量迅速增加，

3、在秋季和冬季都具有較高的含量。而羽片中黃酮含量變化則表現(xiàn)相反的規(guī)律，在春季羽片黃酮含量升高但是到夏季后黃酮含量明顯下降，隨后含量一直處于較低的水平。因此，莖和羽片中的黃酮含量在季節(jié)變化上表現(xiàn)出明顯的負(fù)相關(guān)關(guān)系。羽片、葉軸、根和莖的黃酮類(lèi)化合物提取液的抗氧化活性也隨著不同采集時(shí)間、不同含量而表現(xiàn)不同的清除能力。一般而言，莖的黃酮類(lèi)化合物提取液抗氧化能力最強(qiáng)，可以選取莖作為藥用部位。
　　2.對(duì)紅蓋鱗毛蕨的查爾酮合成酶進(jìn)行基因的克隆與

4、功能分析。以孢子體中提取的RNA、DNA為模板，通過(guò)PCR技術(shù)獲得紅蓋鱗毛蕨的查爾酮合成酶基因ORF序列和基因組序列。生物信息學(xué)分析表明，該基因ORF區(qū)為1212bp，編碼403個(gè)氨基酸，含有一個(gè)內(nèi)含子并且遵循gt/ag剪切規(guī)則。BLAST序列比對(duì)發(fā)現(xiàn)本實(shí)驗(yàn)所獲得CHS基因與其它物種的該基因序列具有較高的同源性，構(gòu)建進(jìn)化樹(shù)進(jìn)行同源性分析，表明紅蓋鱗毛蕨CHS基因與漸尖毛蕨、槐葉萍、水蕨等蕨類(lèi)的CHS基因親緣關(guān)系更近。蛋白序列比對(duì)表明紅蓋

5、鱗毛蕨CHS蛋白具有Cys170，His314，Asn347等CHS活性位點(diǎn)和G383FGPG信號(hào)序列。將CHS目的片段與PET32a載體連接構(gòu)建原核表達(dá)載體轉(zhuǎn)化到大腸桿菌BL21中，使用IPTG誘導(dǎo)蛋白表達(dá)，進(jìn)行SDS-PAGE分析和Westernblotting驗(yàn)證，紅蓋鱗毛蕨CHS基因在大腸桿菌中得到表達(dá)，形成了一個(gè)大小為63KD的蛋白，與預(yù)期結(jié)果相符合。體外酶活實(shí)驗(yàn)驗(yàn)證了原核表達(dá)的紅蓋鱗毛蕨CHS蛋白具有活性，能催化底物生成柚皮