金黃色葡萄球菌EsxB蛋白與其抗血清的制備及EsxB抗體陽性菌株耐藥性分析研究.pdf

1、目的:制備金黃色葡萄球菌(金葡菌)EsxB蛋白及其抗血清,了解能分泌EsxB蛋白的葡萄球菌在臨床感染患者中的分布情況以及EsxB抗體陽性與菌株產(chǎn)生耐藥的相關(guān)性,推測(cè)EsxB是否能成為金葡菌疫苗的候選靶抗原,為其進(jìn)一步的臨床運(yùn)用奠定實(shí)驗(yàn)基礎(chǔ)。
　　方法:(1)以S. aureus野生株基因組DNA為模板,用設(shè)計(jì)的esxB特異性引物進(jìn)行PCR擴(kuò)增得到esxB基因DNA片段。(2)將esxB克隆到原核表達(dá)載體pET-28a(+)多克隆位

2、點(diǎn)中(BamH I和Xho I),篩選陽性質(zhì)粒。(3)對(duì)陽性質(zhì)粒進(jìn)行測(cè)序分析,將測(cè)序結(jié)果和esxB基因序列進(jìn)行比對(duì)分析。(4)pET-28a(+)/esxB重組質(zhì)粒經(jīng)誘導(dǎo)表達(dá)蛋白,借助抗-HisAb用Western blotting進(jìn)行鑒定。(5)用制備的蛋白對(duì)小鼠進(jìn)行免疫,對(duì)獲得的抗血清用ELISA方法進(jìn)行效價(jià)的測(cè)定,用Western blotting進(jìn)行特異性測(cè)定。(6)用補(bǔ)體介導(dǎo)的抗體殺菌試驗(yàn)檢測(cè)抗血清的有效濃度。(7)包被Esx

3、B蛋白用間接ELISA法檢測(cè)50份正常健康對(duì)照、110例其他葡萄球菌感染患者和78例金葡菌感染患者血清樣本中抗EsxB蛋白抗體的表達(dá)。(8)EsxB蛋白抗體陽性患者所相應(yīng)的分離菌株用全自動(dòng)微生物系統(tǒng)進(jìn)行藥敏試驗(yàn)的檢測(cè)。
　　結(jié)果:(1)PCR擴(kuò)增得到長(zhǎng)度為315 bp的DNA片段。(2)篩選出的重組克隆陽性質(zhì)粒,經(jīng)鑒定,其目的片段的大小與預(yù)期相符,陽性質(zhì)粒經(jīng)測(cè)序,證實(shí)序列完全正確。(3)誘導(dǎo)表達(dá)的蛋白條帶位于16KD左右,純化的蛋

4、白也在同一位置,經(jīng)證實(shí)該蛋白條帶為EsxB融合蛋白。(4)免疫小鼠制備得到的抗血清效價(jià)和特異性與預(yù)期結(jié)果相符,其有效殺菌濃度為1:4000。(5)其他葡萄球菌感染的患者EsxB抗體陽性7例,陽性率為6.4％;金葡菌感染臨床樣本中共有22例陽性,陽性率為28.2％,兩者有顯著性差異。(6)EsxB抗體陽性患者金葡菌多重耐藥例數(shù)顯著高于EsxB抗體陰性的金葡菌患者,且MRSA也顯著增高。
　　結(jié)論:(1)經(jīng)鑒定,制備、純化的金葡菌Es