草魚補(bǔ)體C9和穿孔素基因的克隆與表達(dá)研究.pdf

1、C9是補(bǔ)體溶解途徑膜攻擊復(fù)合體的一個成員。穿孔素是主要存在于自然殺傷細(xì)胞和細(xì)胞毒性T淋巴細(xì)胞細(xì)胞毒顆粒中的一種糖蛋白，兩個分子都可以聚合形成環(huán)狀結(jié)構(gòu)插入靶細(xì)胞膜導(dǎo)致細(xì)胞溶解，具有結(jié)構(gòu)和功能的相似性。本研究對草魚Ctenopharyngodonideilus補(bǔ)體C9(grasscarpC，gcC9)和穿孔素(grasscarpperforin，gcPFP)基因進(jìn)行了克隆鑒定和特征分析。 使用RACE方法擴(kuò)增得到gcC9的cDNA全

2、長2123bp，開放閱讀框包含1953bp，編碼650個氨基酸，理論分子量71.045kDa。結(jié)構(gòu)域搜索和多序列比對顯示gcC9含有血小板反應(yīng)素(thrombospondindomain，TSP)、低密度脂蛋白受體(10wdensitylipoproteinreceptorclassA，LDL-R)、表皮生長因子前體(epidermalgrowthfactorprecursor，EGFP)和與穿孔素相關(guān)的MACPF結(jié)構(gòu)域。使用PCR和染

3、色體步移法獲得gcC9基因全長7003bp，包含11個外顯子和10個內(nèi)含子，啟動子區(qū)域822bp，含有一個典型的TATA框及C/EBP，HSF，NF-AT，CHOP-C，HNF-3B，GATA-2，IK-2，EVI-1，AP-1，CP2和Oct-1等潛在的轉(zhuǎn)錄因子結(jié)合位點(diǎn)。RT-PCR和實(shí)時熒光定量PCR顯示geC9在草魚未受精卵中已表達(dá)，受精后48hgcC9表達(dá)量達(dá)到峰值。使用pQE-30載體對gcC9進(jìn)行原核表達(dá)，獲得重組蛋白免疫兔

4、子制備多克隆抗體，Western免疫印跡和RT-PCR顯示gcC9在健康草魚肝臟、腸道、脾臟、頭腎、中腎、胸腺、皮膚、肌肉、鰓、心臟、腦和血液中表達(dá)，其中肝臟中表達(dá)量最高。實(shí)時熒光定量PCR分析顯示經(jīng)滅活的柱狀黃桿菌Flavobacteriumcolumnare誘導(dǎo)后1d和7dgcC9轉(zhuǎn)錄分別在肝臟和脾臟中有顯著上調(diào)；PolyI:C誘導(dǎo)后1d和3d，在脾臟、肝臟和頭腎中顯著上調(diào)。 使用簡并引物擴(kuò)增得到gcPFP-1和gcPFP-

5、2的兩個片段，使用RACE擴(kuò)增獲得gcPFP-1cDNA全長2514bp，開放閱讀框包含1767bp，編碼588個氨基酸；gcPFP-2cDNA全長2254bp，其中開放閱讀框1740bp，編碼579個氨基酸。gcPFP-1和gcPFP-2氨基酸相同率為58％，結(jié)構(gòu)預(yù)測顯示都存在MACPF和C2的PFP的特征結(jié)構(gòu)域。gcPFP-1和gcPFP-2基因全長分別是4090bp和3059bp，均由4個外顯子和3個內(nèi)含子組成。RT-PCR顯示g

6、cPFP-1和gcPFP-2轉(zhuǎn)錄本在健康草魚被檢組織中都有分布，在草魚早期發(fā)育階段兩個基因都在孵化后6h開始表達(dá)，48h表達(dá)量達(dá)到峰值，之后表達(dá)下降，呈現(xiàn)相同的表達(dá)規(guī)律。蛋白免疫印跡顯示gcPFP-1和gcPFP-2可以交叉識別兔抗gcPFP抗體，草魚組織中g(shù)cPFP-1和gcPFP-2均為68kDa左右的蛋白，在健康草魚組織中呈組成型表達(dá)。滅活的柱狀黃桿菌誘導(dǎo)后7d，在脾臟和頭腎中g(shù)cPFP-1和gcPFP-2表達(dá)上調(diào)；PolyI：C

7、誘導(dǎo)后1d在脾臟，誘導(dǎo)后3d在頭腎和腸道中檢測到gcPFP-1和gcPFP-2表達(dá)上調(diào)。兩種誘導(dǎo)劑作用后3d，肝臟中g(shù)cPFP-1表達(dá)上調(diào)而gcPFP-2表達(dá)下調(diào)。 GcC9和gcPFP結(jié)構(gòu)相關(guān)，氨基酸序列同源性為22％，共同含有MACPF和富含半胱氨酸的EGFP結(jié)構(gòu)域，這些區(qū)域具有使蛋白構(gòu)成跨膜通道和單體多聚化的功能。本研究首次提出魚類穿孔素存在多種亞型，斑馬魚Daniorerio、黑青斑河豚Tetraodonnigrovir