草魚g-型和c-型溶菌酶基因的克隆、組織分布與原核表達(dá).pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國(guó)淡水養(yǎng)殖最重要的魚類品種之一，位居“四大家魚”之首。草魚養(yǎng)殖業(yè)在我國(guó)農(nóng)業(yè)經(jīng)濟(jì)中具有重要的意義。在草魚養(yǎng)殖過程極易發(fā)生病害。對(duì)于養(yǎng)殖魚類而言，免疫防治是控制疾病重要而有效的途徑。由于魚類特異性免疫系統(tǒng)尚不完善，因此非特異性免疫因子在抵抗外來病原的入侵中起重要作用。溶菌酶是生物體內(nèi)重要的非特異免疫因子之一，在引發(fā)和維持機(jī)體防御免疫的過程中起重要作用。本實(shí)驗(yàn)克隆了草魚g-型和c-型

2、溶菌酶基因全長(zhǎng)cDNA，并用熒光定量PCR方法檢測(cè)了草魚正常個(gè)體和受嗜水氣單胞菌感染后各組織中溶菌酶基因的表達(dá)情況，初步評(píng)價(jià)它們的免疫防御功能。同時(shí)應(yīng)用基因工程技術(shù)將兩種溶菌酶基因成熟肽cDNA導(dǎo)入原核表達(dá)載體獲得重組草魚溶菌酶，并比較二者的活性與抗菌譜，探討兩種草魚溶菌酶的免疫防御功能，為進(jìn)一步開展魚類免疫分子機(jī)制的研究奠定基礎(chǔ)。 1.草魚g-型和c-型溶菌酶基因的克隆與序列分析 采用RT-PCR和5’RACE技術(shù)分別

3、從草魚的肝臟組織的法分別擴(kuò)增出g-型和c-型溶菌酶的3’和5’端序列。mRNA中獲得特異性cDNA3’和5’片段，將3’和5’端序列用vector軟件拼接獲得純化后克隆到pMD18-T載體中，重組子經(jīng)測(cè)序、和序列拼接，獲得草魚g-型和c-型溶菌酶cDNA。序列分析表明草魚g-型溶菌酶基因cDNA全長(zhǎng)為777bp，包括558 bp的開放閱讀框(ORF)，編碼185個(gè)氨基酸，5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)分別為107 bp和112 bp。草魚g

4、-型溶菌酶中存在g-型溶菌酶所具有的3個(gè)保守的催化殘基(Glu73，Asp86，Asp97)；和其他魚類一樣，草魚g-型溶菌酶不具有哺乳動(dòng)物和鳥類所具有的保守的二硫鍵，表明草魚g-型溶菌酶是非分泌性蛋白。氨基酸序列同源性分析表明，草魚g-型溶菌酶與已知的牙鲆、大黃魚和鯉魚等魚類的同源性在55％-79％之間。與斑馬魚的同源性最高，為79％，與大西洋鱈的同源性最低的，為55％。草魚c-型溶菌酶基因全長(zhǎng)cDNA，含438 bp的ORF，編碼1

5、45個(gè)氨基酸，前18個(gè)氨基酸殘基為信號(hào)肽。5’非編碼區(qū)和3’非編碼區(qū)分別為75bp和175bp，草魚c-型溶菌酶中存在著典型的c-型溶菌酶所具有的兩個(gè)保守的催化位點(diǎn)Glu53(E)和Asp70(D)與8個(gè)保守的半胱氨酸Cys(C)。草魚c-型溶菌酶在101、106、107位置不具有鈣結(jié)合亞型3個(gè)保守的Asp(D)，屬于c-型溶菌酶中的非鈣結(jié)合亞型。氨基酸序列同源性分析表明，草魚c-型溶菌酶與已知的圓鲆、塞內(nèi)加爾鰨和鯉魚等魚類的同源性在3

6、4％-82％之間。與鯉魚同源性最高，為82％，與奧利亞羅非魚同源性最低，為34％。 2.草魚g-型和c-型溶菌酶的組織表達(dá) 2.1兩種溶菌酶在草魚正常個(gè)體中的組織分布 用熒光定量PCR方法對(duì)兩基因的mRNA水平的組織分布進(jìn)行了分析。結(jié)果顯示在正常草魚中所檢測(cè)的11種組織均有g(shù)-和c-型溶菌酶基因表達(dá)，但二個(gè)基因的組織表達(dá)量不同，g-型溶菌酶在所檢測(cè)的各組織中表達(dá)量較均一，但與c-型溶菌酶基因相比，大多數(shù)組織的表達(dá)

7、水平均較低。c-型溶菌酶各組織中表達(dá)量差異較大，在頭腎中高表達(dá)(是腦的444.8倍)。 2.2人工感染嗜水氣單胞菌后兩種溶菌酶基因在草魚各組織中的表達(dá) 人工感染實(shí)驗(yàn)顯示，感染嗜水氣單胞菌后g-和c-型溶菌酶基因表達(dá)均有上調(diào)，g-型溶菌酶基因的表達(dá)總體上調(diào)幅度比c-型溶菌酶的大。在所檢測(cè)的4種組織中，g-型和c-型兩種溶菌酶在肝臟的表達(dá)水平升幅最大(分別是對(duì)照組的12.6倍和5.2倍)，脾臟和鰓中g(shù)-型溶菌酶基因的表達(dá)水平

8、也顯著性升高。頭腎中二種基因表達(dá)上調(diào)的幅度均較小，g-型溶菌酶在頭腎中出現(xiàn)高峰時(shí)間的較遲，第7d才達(dá)到最高峰，但到14d時(shí)仍維持高水平。人工感染結(jié)果表明草魚g-型溶菌酶和c-型溶菌酶均具有抵抗細(xì)菌入侵的作用，但二者可能存在著不同的作用機(jī)制及功能上的分工。 3.草魚g-型和c-型溶菌酶基因的原核表達(dá)、蛋白純化及活性檢測(cè) 將二種溶菌酶基因的成熟肽cDNA分別插入表達(dá)載體pET-30c(+)，構(gòu)建重組His融合表達(dá)載體。經(jīng)轉(zhuǎn)化

9、大腸桿菌、IPTG誘導(dǎo)表達(dá)，SDS-PAGE檢測(cè)到分子量約30 kD和20kD的特異蛋白帶，分別與預(yù)期的g-型溶菌酶和c-型溶菌酶分子大小相符，表明實(shí)驗(yàn)成功獲得了兩種溶菌酶的融合表達(dá)蛋白。 重組蛋白經(jīng)His Bind柱純化后，依照比濁法檢測(cè)其溶菌酶活性。結(jié)果顯示重組草魚溶菌酶活力檢測(cè)顯示兩種重組溶菌酶對(duì)溶壁微球菌和6種水生動(dòng)物病原菌均具有溶菌活性，但二種重組酶對(duì)不同菌的溶菌活性不同?；盍z測(cè)結(jié)果佐證了二種溶菌酶在草魚體內(nèi)的免疫防

10、御功能及功能上存在的分工。 小結(jié)：本實(shí)驗(yàn)克隆了二種草魚溶菌酶——g-型和c-型溶菌酶，它們均具有相應(yīng)的酶典型結(jié)構(gòu)特征。兩種溶菌酶在正常個(gè)體中均具有廣泛的組織分布，但組織分布模式不同，g-型溶菌酶各組織表達(dá)量均較c-型溶菌酶的低，c-型溶菌酶在頭腎中高水平表達(dá)，推測(cè)c-型溶菌酶是草魚機(jī)體正常情況下的主要免疫防御因子。人工感染細(xì)菌后，二個(gè)基因的表達(dá)均上調(diào)，g-型溶菌酶基因上調(diào)幅度均較c-型溶菌酶基因的高。二個(gè)基因在肝臟的上調(diào)幅度均最