中國對蝦血小板反應(yīng)素和C-型凝集素基因克隆表達(dá)和功能研究.pdf

1、中國對蝦是我國重要的海產(chǎn)養(yǎng)殖品種，在沿海地區(qū)海產(chǎn)品養(yǎng)殖中占有重要的經(jīng)濟(jì)地位，養(yǎng)殖對蝦不僅給人們的生活提供了美味可口的食品，而且提供了大量的就業(yè)崗位，促進(jìn)了經(jīng)濟(jì)的發(fā)展。然而，自從上世紀(jì)九十年代以來，對蝦傳染性疾病的流行，特別是病毒的感染給正在蓬勃發(fā)展的對蝦養(yǎng)殖帶來了很大的損失，因而，找到一種有效的控制對蝦疾病的診斷和治療方法已經(jīng)變得越來越緊迫。 解決這一問題除了要考慮對蝦合適的養(yǎng)殖環(huán)境，對蝦的自然生態(tài)環(huán)境外，還要研究清楚對蝦的免疫

2、機(jī)理，給對蝦疾病的治療提供一定的理論依據(jù)。同其他無脊椎動(dòng)物一樣，對蝦中只存在先天免疫，包括細(xì)胞免疫和體液免疫。對蝦的血細(xì)胞在免疫過程中起決定性作用，主要是參與病原的吞噬，形成結(jié)節(jié)和包被。這些反應(yīng)與病原微生物的識別，抗菌肽的產(chǎn)生，血淋巴的結(jié)合黑化緊密相連，從而構(gòu)成了對蝦嚴(yán)謹(jǐn)而有效的免疫屏障。 我們利用一系列的生物化學(xué)和分子生物學(xué)方法，研究對蝦先天免疫相關(guān)基因及其功能，試圖從一定層面上了解對蝦的免疫機(jī)制，為對蝦疾病的防治提供理論依據(jù)

3、，同時(shí)為整個(gè)生物界免疫系統(tǒng)的研究提供一定的信息。 本論文主要是報(bào)道了中國對蝦兩個(gè)免疫相關(guān)基因：C-型凝集素(C-type lectin)和血小板反應(yīng)素(TSP)的分子克隆和功能分析，主要結(jié)果如下： 1.中國對蝦C-型凝集素的克隆和功能研究 凝集素通過對病原微生物細(xì)胞表面的糖分子的識別，可以區(qū)分“非己”的物質(zhì)，在生物的免疫應(yīng)答中起重要作用。我們從中國對蝦中得到一種新型的凝集素，命名為Fc-lectin，通過功能域

4、的預(yù)測和分析發(fā)現(xiàn)，它含有糖分子識別結(jié)構(gòu)域(carbohydrate-recognition domains，CRDs)，因此，它是一種C-型凝集素。Fc-lectin基因全長為571bp,開放閱讀框(ORF)為477bp，編碼159個(gè)氨基酸，其氨基酸序列中含 有CELECT 或稱糖基識別結(jié)構(gòu)域。通過與其他動(dòng)物的凝集素序列比對發(fā)現(xiàn)，F(xiàn)e-Ictin的CELECT結(jié)構(gòu)域與其它物種的相似性很低，即使與來自另一種對蝦(Penaeus m

5、onodon)的凝集素(PmAV)比較，其相似性也只有0.289． 半定量PCR(RT-PCR)顯示，F(xiàn)c-lectin在正常對蝦和刺激對蝦的肝胰腺，刺激對蝦的胃中有表達(dá)，在肝胰腺中，刺激對蝦Fc-lectin的表達(dá)量遠(yuǎn)遠(yuǎn)高于正常對蝦，而在正常對蝦的胃中沒有表達(dá)，因此推斷，其在對蝦的肝胰腺組織組成性表達(dá)，但刺激后表達(dá)上調(diào)，在胃組織是誘導(dǎo)表達(dá)。 肝胰腺組織原位雜交和熒光免疫組化的結(jié)果顯示Fc-Iectin在刺激對蝦的

6、肝胰腺表達(dá)量上調(diào)，這個(gè)結(jié)果與半定量PCR的結(jié)果是一致的，不同組織Westen Blotting的結(jié)果顯示Fc-lectin在刺激對蝦的肝胰腺和胃中有雜交信號，這個(gè)結(jié)果也與半定量PCR的結(jié)果一致，因此推斷Fc-lectin在中國對蝦防御病原微生物的過程中有重要作用。 構(gòu)建了Fc-lec-pEr3a(+)重組質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化大腸桿菌BL21，獲得高表達(dá)量的重組蛋白，通過管碟法(Oxford cup)和液體抑制實(shí)驗(yàn)等方法測試重組蛋白的抑菌活

7、性和最小抑菌濃度(MIC)，發(fā)現(xiàn)其對革蘭氏陽性菌和真菌的抑菌能力較強(qiáng)，對革蘭氏陰性菌有一定的抑菌能力。細(xì)菌結(jié)合試驗(yàn)發(fā)現(xiàn)Fc-lectin、可以結(jié)合巨大芽孢桿菌，蘇蕓金芽胞桿菌，滕黃微球菌和金黃色葡萄球菌等革蘭氏陽性菌，以及革蘭氏陰性菌，大腸桿菌。而不結(jié)合革蘭氏陽性菌，枯草桿菌和革蘭氏陰性菌克雷伯士氏肺炎桿菌。 2．中國對蝦血小板凝集素(TsP)的克隆和表達(dá)研究 血小板反應(yīng)素(TSPs)是一個(gè)多結(jié)構(gòu)域的鈣離子結(jié)合細(xì)胞外糖

8、蛋白。其結(jié)構(gòu)和功能已經(jīng)在脊椎動(dòng)物上進(jìn)行了廣泛的研究，到現(xiàn)在為止已經(jīng)發(fā)現(xiàn)TSPs家族至少包括五個(gè)同源基因。其中TSP-1/2/5研究的比較深入，它們在血小板聚合，炎癥反應(yīng)中有重要作用。同時(shí)它可以調(diào)節(jié)傷口愈合和腫瘤生長的細(xì)胞分化，因此也被看成一種抑癌基因。 我們從中國對蝦血細(xì)胞抑制消減雜交(SSH)文庫中獲得數(shù)段血小板反應(yīng)素的cDNA片斷，通過3’和5’末端快速擴(kuò)增(3’RACE and 5’RACE)得到血小板反應(yīng)素的全長序列，命

9、名為Fc-TSP。該基因全長共2908bp，其開放閱讀框編碼938個(gè)氨基酸序列。中國對蝦血小板反應(yīng)素主要包含幾丁質(zhì)結(jié)合(ChtBD2)，外皮生長因子 (EGF),TSP-3功能域和其特征性功能域TSP-C，其與日本對蝦(Marsupenaeusjaponicus)三個(gè)血小板反應(yīng)素基因的相似性分別為：46.3％，46.9％和51.9％。 通過組織原位雜交，Northern blot，半定量PCR(RT-PCR)對正常和刺激的中國

10、對蝦血小板反應(yīng)素的表達(dá)和組織分布進(jìn)行了研究，Northern blot顯示其在正常和刺激對蝦的血細(xì)胞，心臟，中腸和卵巢組織中有雜交信號，同時(shí)刺激組織的雜交信號相對較強(qiáng)。在正常對蝦的肝胰腺中沒有雜交信號，而在刺激對蝦的肝胰腺中呈現(xiàn)較強(qiáng)的雜交信號，這個(gè)結(jié)果與肝胰腺原位雜交的結(jié)果一致。然而半定量PCR的結(jié)果顯示血小板反應(yīng)素在刺激和正常對蝦的所有組織，包括血細(xì)胞，肝胰腺，心臟，中腸，胃，鰓，卵巢和精巢都有表達(dá)。同時(shí)除了卵巢和精巢外，刺激組織的表

11、達(dá)量高于正常組織，特別是肝胰腺。可以看出，在刺激對蝦的肝胰腺，血細(xì)胞，中腸，心臟和胃組織中血小板反應(yīng)素的表達(dá)量上調(diào)。根據(jù)TSP的分子結(jié)構(gòu)和表達(dá)模式因此推斷血小板反應(yīng)素具有多種功能：(1)Fc-TSP的氨基端有三個(gè)幾丁質(zhì)結(jié)構(gòu)域，暗示其可能有幾丁質(zhì)結(jié)合活性，可能參與幾丁質(zhì)的組裝和傷口修復(fù)；(2)Fe-TSP在對蝦血細(xì)胞中上調(diào)表達(dá)，在肝胰腺中誘導(dǎo)表達(dá)，說明其可能與免疫防御有關(guān)；(3)Fc-TSP在卵巢中的高水平表達(dá)，暗示其可能與日本對蝦的TS