兩種新型家蠶凝集素基因的克隆及表達.pdf

1、在昆蟲的免疫中，識別蛋白參與到對病原體的識別中。C型凝集素(C-type Lectin)是先天性免疫的模式識別受體，其含有1個或者多個糖基識別域(carbohydrate-recognition domain，CRD)。由于Ca2+在此類凝集素中是很重要的，所以此類凝集素稱為C型凝集素。C型凝集素在識別微生物表面的糖分子后，會通過激活體內(nèi)免疫系統(tǒng)來清除入侵的微生物。
　　 本文以鱗翅目昆蟲家蠶(Bombyx mori)為實驗材料

2、，首先鑒定了2個C型凝集素，命名為BmLectin-10和BmLectin-11，然后通過注射微生物的方法研究它們在免疫中的作用。研究結(jié)果如下：
　　 1.基因鑒定及序列分析：從家蠶基因組中預測了兩個C型凝集素，并用RT-PCR獲得了這兩個基因cDNA的全長序列。其中BmLectin-10為990bp，含有EPD和EPN基序，分析BmLectin-10的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，該蛋白有兩個糖識別結(jié)構(gòu)域，一個短型的CRD結(jié)構(gòu)位于N端第16

3、到150個氨基酸，一個長型的CRD結(jié)構(gòu)位于C端第162到301個氨基酸。它的氨基酸序列和含有兩個CRD的C型凝集素是很相似的。BmLectin-10的氨基酸序列與煙草天蛾(Manduca sexta)immulectin-2的相似度達到96％，與棉鈴蟲(Helicoverpa armigera)的相似度達到95％。
　　 BmLectin-11為810bp，含有QPD基序，分析BmLectin-11的氨基酸序列發(fā)現(xiàn)，該蛋白質(zhì)含有

4、一個信號肽，位于第1到21個氨基酸；還有一個CRD結(jié)構(gòu)，位于第45到203個氨基酸，它和短型的CRD相似。BmLectin-11的氨基酸序列與果蠅(Drosophila melanogaster)的相似度達到96％，與岡比亞按蚊(Anophelesgambiae)的相似度達到95％。
　　 2.組織特異性分析：本文選取五齡家蠶的中腸、頭、脂肪體、表皮、馬氏管、血淋巴、絲腺等組織，用RT-PCR的方法分析BmLectin-10和B

5、mLectin-11在不同組織中的表達情況，結(jié)果發(fā)現(xiàn)BmLectin-10在脂肪體中的表達量較高，在表皮和頭部中的表達較少；BmLectin-11在脂肪體的表達量高于在表皮中的。其他組織均無表達。
　　 3.C型凝集素對微生物的識別作用：用RT-PCR的方法研究微生物對BmLectin-10和BmLectin-11表達量的影響。結(jié)果發(fā)現(xiàn)，在大腸桿菌入侵后24h時BmLectin-10的相對表達量升高的極為顯著；在釀酒酵母入侵后6

6、h時BmLectin-11的相對表達量顯著升高。這說明BmLectin-10可能對G-有特異的識別作用，BmLectin-11對真菌有特異的識別作用，而BmLectin-10和BmLectin-11對G+的識別作用不顯著。
　　 4.原核表達：構(gòu)建重組質(zhì)粒BmLectin10-pET32a和BmLectin11-pET32a轉(zhuǎn)化表達菌株BL21(DE3)，得到了BmLectin-10和BmLectin-11的重組蛋白。通過分析發(fā)

7、現(xiàn)重組蛋白存在于沉淀中，在尿素變性后利用帶鎳離子的純化填料進行親和層析，獲得了可溶性的重組蛋白。
　　 綜上所述，本文對得到的兩個新型C型凝集素進行了序列分析，發(fā)現(xiàn)BmLectin-10序列和含有兩個結(jié)構(gòu)域的C型凝集素相似度很高，而BmLectin-11和含有一個結(jié)構(gòu)域的C型凝集素相似度很高，這說明BmLectin-10和BmLectin-11同屬于C型凝集素家族，但是在模式識別方面可能存在差異。注射不同的微生物后發(fā)現(xiàn)，BmLe