大豆凝集素基因lec-s的克隆及轉(zhuǎn)化煙草的研究.pdf

1、凝集素是具有一個(gè)或多個(gè)非催化性的結(jié)構(gòu)域，可與單糖或多糖可逆結(jié)合的一類(lèi)蛋白質(zhì)或糖蛋白。目前為止，人們已經(jīng)從多種植物、動(dòng)物、細(xì)菌、病毒和真菌中分離出凝集素。迄今為止已發(fā)現(xiàn)的許多凝集素中，植物凝集素是最大的一個(gè)家族，尤以豆科植物的種子中凝集素含量最為豐富。以往的報(bào)道表明，植物凝集素在植物中具有防御功能。在正常情況下，植物凝集素僅作為儲(chǔ)存蛋白而不表現(xiàn)任何特異活性;一旦植物受到微生物、昆蟲(chóng)等動(dòng)物的危害，植物凝集素就會(huì)從植物的受害細(xì)胞釋放出來(lái)，與病

2、原物或昆蟲(chóng)消化道特定的糖蛋白結(jié)合，擾亂其正常的生理生化功能，最終表現(xiàn)為對(duì)病蟲(chóng)害的抗性。目前為止，已經(jīng)有雪花蓮凝集素基因、豌豆外源凝集素基因、菜豆凝集素基因、莧科凝集素基因以及Ⅱ型核糖體失活蛋白基因等許多植物凝集素基因成功地用于植物抗病蟲(chóng)害基因工程。
　　 在本實(shí)驗(yàn)室的前期工作中，我們利用RACE和反向PCR技術(shù)從大豆品種合豐29號(hào)中分離得到一個(gè)新的大豆凝集素基因，命名為lec-s(DQ235094)。本研究旨在將編碼大豆凝集素的

3、基因lec-s轉(zhuǎn)化煙草，以期提高煙草的抗病性和抗蟲(chóng)性，為將來(lái)該基因應(yīng)用于植物病害的防治提供依據(jù)。
　　 通過(guò)RT-PCR方法，我們從大豆抗病品種合豐29號(hào)中克隆lec-s基因，將其插入入植物表達(dá)載體pBI121，構(gòu)建植物表達(dá)載體pBI121::lec-s。將重組載體轉(zhuǎn)化至大腸桿菌DH5α中，經(jīng)酶切、測(cè)序驗(yàn)證后，通過(guò)凍融法轉(zhuǎn)化根癌農(nóng)桿菌EHA105。菌落PCR和酶切檢測(cè)后，挑選陽(yáng)性克隆供轉(zhuǎn)化煙草使用。
　　 采用根癌農(nóng)桿菌

4、EHA105介導(dǎo)的葉盤(pán)法，將重組表達(dá)質(zhì)粒pBI121:: lec-s轉(zhuǎn)化煙草，獲得了抗卡那霉素的轉(zhuǎn)基因煙草植株。經(jīng)PCR、Southern雜交和RT-PCR檢測(cè)證明lec-s基因已整合到煙草基因組中，并且能在轉(zhuǎn)錄水平正常表達(dá)。
　　 抗TMV鑒定結(jié)果表明，轉(zhuǎn)基因煙草葉片上的病斑數(shù)顯著減少，與對(duì)照相比病斑減少了41.72％～43.79％，說(shuō)明轉(zhuǎn)基因煙草表現(xiàn)出對(duì)TMV的良好抗性?？篃煵菀呙梗≒hytophthora nicotian

5、ae）的測(cè)定發(fā)現(xiàn)，轉(zhuǎn)基因煙草強(qiáng)于未轉(zhuǎn)化煙草和轉(zhuǎn)空載體煙草。qRT-PCR檢測(cè)發(fā)現(xiàn)，接種TMV后，抗病防衛(wèi)基因（PR-1a、GST1、Pa1和hsr515）在轉(zhuǎn)基因煙草葉片中顯著上調(diào)表達(dá)。這些結(jié)果表明，大豆凝集素基因lec-s轉(zhuǎn)化煙草可對(duì)TMV產(chǎn)生抗性，其作用機(jī)制可能在于lec-s基因誘導(dǎo)抗病防衛(wèi)基因在植株體內(nèi)的表達(dá)，增強(qiáng)了植株的系統(tǒng)抗性。此外轉(zhuǎn)基因煙草對(duì)甜菜夜蛾（Spodoptera exigua）的抗蟲(chóng)實(shí)驗(yàn)表明，大豆凝集素轉(zhuǎn)基因煙草也