乙型肝炎病毒B，C基因型X蛋白在原核系統(tǒng)中的克隆表達(dá)與純化.pdf

1、目的： 應(yīng)用分子克隆技術(shù)獲得乙型肝炎病毒(HBV)B、C基因型X蛋白，為進(jìn)一步研究X基因在乙型肝炎病毒所致疾病中的作用奠定基礎(chǔ)。 方法： ①基因克隆：應(yīng)用PCR技術(shù)，分別從本實(shí)驗(yàn)室構(gòu)建的B、C基因型HBV保守的X基因真核表達(dá)重組子—pcDNA3.1-Xb和pcDNA3.1-Xc中獲取X全長(zhǎng)基因，產(chǎn)物經(jīng)EeoR I和XhoI酶切，分別與原核表達(dá)載體pET-42a連接，轉(zhuǎn)化BL-21感受態(tài)細(xì)胞，抗生素篩選陽(yáng)性重組子，

2、PCR、酶切、測(cè)序鑒定。 ②蛋白表達(dá)純化：取鑒定后的B，C基因型X基因重組菌，IPTG誘導(dǎo)重組蛋白的表達(dá)，SDS-PAGE電泳，用GST抗體經(jīng)Western Breeze化學(xué)發(fā)光法鑒定融合蛋白。優(yōu)化誘導(dǎo)時(shí)間和IPTG濃度，誘導(dǎo)重組蛋白大量表達(dá)；低溫誘導(dǎo)可溶性X蛋白的形成。分別用GST和Ni-NTA bind純化試劑盒純化X蛋白，比較兩種方法的純化效果，并用Bradford法測(cè)定重組蛋白濃度。 結(jié)果： ①PCR法獲

3、取的乙型肝炎病毒B、C基因型X基因的大小與預(yù)期一致；克隆后篩選的陽(yáng)性重組子經(jīng)PCR、酶切、測(cè)序鑒定正確。 ②重組子均可被IPTG誘導(dǎo)表達(dá)融合蛋白，表達(dá)產(chǎn)物可被GST抗體識(shí)別：當(dāng)誘導(dǎo)時(shí)間為2 h、IPTG終濃度為0.5 mMol/L時(shí)，表達(dá)量均達(dá)最大，約為菌體總蛋白的40％以上：18℃，25℃，30℃均難以誘導(dǎo)可溶性蛋白的產(chǎn)生；溶解后的包涵體經(jīng)復(fù)性后進(jìn)行GST純化，但是最終未能得到目的蛋白；而用Ni-NTA純化后可直接得到大量融合