野生型及突變型乙型肝炎病毒X基因的克隆、表達(dá)、純化及免疫鑒定.pdf

1、研究背景及目的:
　　 乙型肝炎病毒(HBV)感染是影響全球人類健康的重要疾病，HBV慢性感染是形成人類肝細(xì)胞癌的主要致病因素。HBV基因組含有4個(gè)開(kāi)放讀碼框架(openreadingframe，ORF)，即S、C、P和X區(qū)。其中，X區(qū)在HBV基因組的第1374-1838位核苷酸，長(zhǎng)約465個(gè)堿基，是HBV基因組中最小的ORF，其編碼的x蛋白(即乙型肝炎病毒x抗原，HBxAg)與乙型肝炎肝硬化(以下簡(jiǎn)稱為乙肝肝硬化，liverc

2、irrhosis，LC)、原發(fā)性肝細(xì)胞癌(Primaryhepatocellularcarcinoma，HCC)的發(fā)生具有明顯的相關(guān)性。由于HBV復(fù)制體系獨(dú)特，在慢性感染者免疫壓力等因素作用下，HBV經(jīng)常發(fā)生突變。研究發(fā)現(xiàn)由HBV導(dǎo)致的HCC患者體內(nèi)的HBV突變率比無(wú)癥狀攜帶者(asymptomaticcarrier,ASC)體內(nèi)病毒突變率明顯增高，其中最常見(jiàn)的突變類型是A1762T/G1764A雙突變。由于A1762T/G1764A雙

3、突變位于核心啟動(dòng)子(corepromoter,CP)編碼區(qū)，目前許多學(xué)者認(rèn)為A1762T/G1764A雙突變?cè)谝欢ǔ潭壬嫌绊懙紺P的活性。但是，由于HBV基因組中編碼區(qū)具有高度重疊性，A1762T/G1764A雙突變正好引起了HBxAg第130位和131位氨基酸的改變。這種改變很可能會(huì)導(dǎo)致HBV蛋白結(jié)構(gòu)和功能的變化，繼而影響到HBV相關(guān)性腫瘤的發(fā)生和疾病的進(jìn)展。因此，我們構(gòu)建野生型和A1762T/G1764A雙突變型乙型肝炎病毒X基因原

4、核表達(dá)系統(tǒng)，表達(dá)并純化2種抗原，即HBxAg-野生及HBxAg-突變，同時(shí)制備2種抗原相應(yīng)的兔抗血清，為深入研究HBVX基因及其雙突變后對(duì)HBV慢性感染者病情發(fā)展和腫瘤發(fā)生的作用奠定基礎(chǔ)。
　　 方法:
　　 從慢性乙型肝炎患者血清中抽提HBV基因組DNA，經(jīng)PCR擴(kuò)增和基因測(cè)序，證實(shí)并獲得野生型及A1762T/G1764A雙突變型HBVX基因。應(yīng)用TA克隆及亞克隆技術(shù)將2基因分別插入pGEX-6P-2載體，構(gòu)建pGEX

5、-6P-2-HBVXw(野生型)及pGEX-6P-2-HBVXm(A1762T/G1764A雙突變型)重組表達(dá)載體;轉(zhuǎn)化入宿主菌進(jìn)行誘導(dǎo)表達(dá);包涵體復(fù)性后，GSTrapFF蛋白純化柱純化帶有GST標(biāo)簽的野生型和A1762T/G1764A突變型HBVx抗原(HBxAg);應(yīng)用SDS-PAGE、Westernblot和ELISA方法對(duì)表達(dá)的野生型和雙突變型HBxAg進(jìn)行鑒定;分別制備兔抗HBxAg-野生及HBxAg-突變多克隆抗體(HBxA

6、b-野生，HBxAb-突變)，應(yīng)用ELISA方法對(duì)2種抗體分別鑒定;用HiTraprProteinAFF純化柱純化兔HBxAb多克隆抗體。
　　 結(jié)果:
　　 1.SDS-PAGE證實(shí)本研究構(gòu)建的2個(gè)表達(dá)系統(tǒng)均能高效表達(dá)目的蛋白;
　　 2.復(fù)性、純化后野生型和雙突變型GST-HBxAg濃度分別達(dá)到4.88mg/ml和5.07mg/ml;
　　 3.Westernblot鑒定證實(shí)所純化的野生型和雙突變型H

7、BxAg均能被同一種特異性的單克隆抗體所識(shí)別，提示2種重組抗原具有相似的抗原性;
　　 4.ELISA方法檢測(cè)顯示2種抗原都能成功包被于微量滴定板上并與乙肝患者血清反應(yīng);
　　 5.ELISA方法證實(shí)本研究制備的兔多克隆HBxAb-野生及HBxAb-突變均能特異地識(shí)別野生型和雙突變型HBxAg。
　　 結(jié)論:
　　 本研究成功地構(gòu)建了野生型和A1762T/G1764A雙突變型HBVX基因表達(dá)系統(tǒng)，成功制備