野生型和P370L突變型Myocilin原核表達(dá)載體的構(gòu)建及蛋白表達(dá)的初步研究.pdf

1、青光眼已成為世界第二位的致盲眼病。1997年Stone等在《Science》上首先發(fā)表文章，報(bào)道Myocilin基因?yàn)榧易逍蚤_角型青光眼的致病基因。從此，關(guān)于Myocilin基因及蛋白的結(jié)構(gòu)、功能及青光眼的致病作用的研究成為熱點(diǎn)。然而，時(shí)至今日，突變型．Myocilin基因及蛋白在家族性開角型青光眼發(fā)病中的致病作用仍存有爭(zhēng)論。 本課題組在國(guó)內(nèi)率先對(duì)一個(gè)家族性開角型青光眼的家系進(jìn)行了長(zhǎng)達(dá)20年的追蹤調(diào)查，經(jīng)過(guò)系列全面、系統(tǒng)的臨床及

2、實(shí)驗(yàn)室研究，確定Myocilin基因P370L突變是該家系家族性開角型青光眼的致病基因，并將其命名為廣州1號(hào)(GZ.1)；最近課題組又在廣東普寧發(fā)現(xiàn)了一個(gè)新的家族性開角型青光眼家系，命名為普寧1號(hào)(PN．1)，最終測(cè)序結(jié)果再次將致病基因鎖定在了MYOC基因Pro370Leu突變，于GZ.1號(hào)致病基因的定位完全相同，再次證明了該突變?cè)谥袊?guó)南方家族性開角型青光眼的研究中的普遍性和重要性；課題組后續(xù)的實(shí)驗(yàn)室研究顯示，通過(guò)將P370L突變型My

3、ocilin基因真核表達(dá)載體瞬時(shí)轉(zhuǎn)染人小梁細(xì)胞，發(fā)現(xiàn)P370L突變型Myocilin蛋白細(xì)胞外分泌障礙，在胞漿內(nèi)形成積聚體，推測(cè)其致病機(jī)理為P370L突變型Myocilin蛋白錯(cuò)誤折疊、空間構(gòu)象發(fā)生改變，進(jìn)而獲得病理性功能影響小梁細(xì)胞內(nèi)質(zhì)網(wǎng)應(yīng)激反應(yīng)以及線粒體的功能，引發(fā)小梁細(xì)胞級(jí)聯(lián)病理反應(yīng)，影響房水的外流，從而導(dǎo)致青光眼的發(fā)生。本研究為了進(jìn)一步研究野生型和P370L突變型Myocilin蛋白的功能及結(jié)構(gòu)特性，通過(guò)構(gòu)建野生型和P370L突

4、變Myocilin基因原核表達(dá)載體，并進(jìn)行了蛋白表達(dá)的初步研究，旨在利用原核表達(dá)系統(tǒng)，獲得高純度的野生型和P370L突變型Myocilin蛋白，為后續(xù)的工作奠定基礎(chǔ)。 目的 運(yùn)用分子克隆技術(shù)，構(gòu)建野生型和P370L突變型Myocilin原核表達(dá)載體，進(jìn)行野生型和P370L突變型Myocilin蛋白的體外表達(dá)，利用親和層析技術(shù)進(jìn)行蛋白純化，得到野生型和P370L突變型Myocilin蛋白，為下一步的工作奠定基礎(chǔ)。

5、方法 1.應(yīng)用PCR的方法，以課題組已經(jīng)成功構(gòu)建的另一真核載體為模板，擴(kuò)增野生型和P370L突變型Myocilin cDNA； 2.應(yīng)用T4DNA連接酶連接雙酶切后的目的基因和載體。 3.應(yīng)用酶切、PCR、測(cè)序的方法鑒定重組質(zhì)粒。 4.應(yīng)用原核表達(dá)的方法在大腸桿菌中表達(dá)野生型和P370L突變型Myocilin蛋白。 5.應(yīng)用親和層析的方法進(jìn)行野生型和P370L突變型Myocilin-GST融合蛋白

6、的純化。 6.應(yīng)用SDS-PAGE的方法檢測(cè)蛋白的表達(dá)。 結(jié)果 1.目標(biāo)基因可高效擴(kuò)增，所構(gòu)建載體pGEX-4t-1/E-w和pGEX-4t-1/E-370經(jīng)酶切、PCR、測(cè)序鑒定，開放閱讀框無(wú)移碼突變，野生型Myocilin目的基因序列無(wú)任何突變；P370L突變型Myoeilin序列除370突變外，無(wú)任何突變。 2.野生型和P370L突變型Myocilin在原核系統(tǒng)中表達(dá)后與陰性對(duì)照相比，可出現(xiàn)明顯的蛋白條帶，

7、但是表達(dá)量較少；通過(guò)親和層析的方法初步純化野生型和P370L突變型Myocilin-GST融合蛋白后，可在目標(biāo)分子量處看到目標(biāo)條帶，但條帶較弱，并伴有GST蛋白。 結(jié)論 1.野生型和P370L突變型Myocilin原核表達(dá)載體構(gòu)建成功，分別命名為pGEX-4t-1/E-W和pGEX-4t-1/E-370。 2.野生型和P370L突變型Myocilin在原核系統(tǒng)中可被誘導(dǎo)表達(dá)，并且通過(guò)親和層析的方法初步純化了野生型