草魚TRIM32基因克隆表達(dá)及其功能的初步研究.pdf

1、草魚(Ctenopharyngodon idellus)是我國重要的淡水經(jīng)濟(jì)魚類，在我國多個(gè)地區(qū)大規(guī)模養(yǎng)殖。但是隨著草魚養(yǎng)殖業(yè)的大力發(fā)展，草魚的各類疾病頻繁爆發(fā)，目前尚無健康有效的治療方法，這成為草魚養(yǎng)殖難以突破的瓶頸，嚴(yán)重阻礙了草魚養(yǎng)殖業(yè)的可持續(xù)發(fā)展。在抵御各種病原體的入侵時(shí)，天然免疫系統(tǒng)發(fā)揮著至關(guān)重要的作用。
　　TRIM(tripartite-motif protein)家族是機(jī)體先天性免疫的重要成員，在細(xì)胞的增殖、分化、腫

2、瘤的抑制、病毒的抑制等方面發(fā)揮著重要的調(diào)控作用。TRIM家族蛋白，也稱為RBCC家族蛋白，從N端到C端依次是RING結(jié)構(gòu)域、B-box結(jié)構(gòu)域、Coiled-coil結(jié)構(gòu)域。在哺乳動(dòng)物中TRIM32的RING結(jié)構(gòu)域具有E3泛素連接酶的作用，可以調(diào)節(jié)信號通路的傳導(dǎo)，參與機(jī)體的天然免疫反應(yīng)。
　　本論文以草魚TRIM32為主要研究對象，旨在為草魚疾病的防御與治療方面提供進(jìn)一步的理論依據(jù)。主要研究內(nèi)容包括以下幾個(gè)方面:
　　1.利用

3、PCR技術(shù)從草魚的肝臟組織中克隆草魚TRIM32基因的編碼區(qū)全長，并翻譯成對應(yīng)的氨基酸序列。結(jié)果顯示，草魚TRIM32基因共1980 bp，編碼660個(gè)氨基酸。
　　2.對草魚TRIM32進(jìn)行結(jié)構(gòu)域分析、核苷酸序列比對以及遺傳進(jìn)化樹分析。結(jié)果顯示，草魚TRIM32具有TRIM家族3個(gè)典型的結(jié)構(gòu)域，與斑馬魚TRIM32的核苷酸序列同源性較高，且遺傳進(jìn)化樹分析也與斑馬魚TRIM32聚為一支。
　　3.對草魚TRIM32進(jìn)行真核表

4、達(dá)載體的構(gòu)建，并通過間接免疫熒光和Western blotting分析草魚TRIM32的表達(dá)與亞定位情況。結(jié)果顯示草魚TRIM32可以在EPC細(xì)胞中成功表達(dá)，主要以點(diǎn)狀分布在細(xì)胞質(zhì)中，而細(xì)胞核中的表達(dá)量較少。
　　4.采用qPT-PCR檢測草魚TRIM32的組織分布，分析結(jié)果顯示草魚TRIM32在被檢測的11個(gè)組織中均有表達(dá)，其中在頭腎組織中的表達(dá)量明顯高于其他組織。
　　5.采用qPT-PCR檢測草魚TRIM32在不同胚胎

5、發(fā)育時(shí)期的表達(dá)豐度，分析結(jié)果顯示，草魚TRIM32在受精卵時(shí)期、卵裂期和囊胚期的表達(dá)量顯著高于其他時(shí)期(p＜0.05)，隨后表達(dá)量下降，直到出膜后表達(dá)量再次顯著性升高。
　　6.利用雙熒光素酶報(bào)告系統(tǒng)檢測草魚TRIM32對NF-κB信號通路的影響。檢測結(jié)果顯示，實(shí)驗(yàn)組是對照組的1.66倍，說明草魚TRIM32能夠激活NF-κB信號通路，誘導(dǎo)下游的炎癥反應(yīng)。
　　7.構(gòu)建了草魚TRIM32原核表達(dá)載體，并制備了高效價(jià)的抗草魚T