家蠶UBRPS27a基因克隆、表達及其功能的研究.pdf

1、泛肽-核糖體蛋白S27a(ubiquitin-ribosomal protein S27a，uBRPS27a)是泛肽和核糖體蛋白的融合蛋白，N端是泛肽，C端是有C2-C2型鋅指結構域的高度保守的核糖體蛋白。在真核細胞中表達時，被酶解成泛肽和核糖體蛋白。N端的泛肽蛋白主要參與細胞內(nèi)的蛋白質(zhì)選擇性降解過程；C端的核糖體蛋白S27a在翻譯過程中不可缺少。已發(fā)現(xiàn)核糖體蛋白S27a在人結腸癌細胞中過表達，是一個早期生長反應基因；在胰腺癌細胞和臨近

2、胰腺癌細胞的癌前病變組織中也超常表達；在肝癌細胞里也高表達；在胃癌細胞中，該基因的表達也遠高于胃正常黏膜上皮細胞?？傊@個多功能核糖體蛋白在各種活性增殖細胞和瘤組織中高度表達，在多種類型的腫瘤細胞中，該基因的過量表達是一個典型特征。 在對家蠶蛹cDNA文庫測序中，我們發(fā)現(xiàn)一個編碼家蠶泛肽一核糖體蛋白S27a基因的序列，我們對其進行生物信息學的分析并將其命名為：BmUBRPS27a。為研究BmUBRPS27a的功能，將該基因的O

3、RF插入到融合表達載體pET-28a(+)的相應酶切位點，成功構建了原核表達質(zhì)粒pET-28a(+)-BmUBRPS27a，并轉(zhuǎn)化感受態(tài)細胞E.coli BL21(DE3)經(jīng)IPTG誘導表達后，將裂解菌體的上清和沉淀分別進行SDS-PAGE檢測，與陰性對照相比在23.28 kDa處有一特異性條帶，與預期值一致。重組蛋白以可溶的形式表達，通過親和層析純化了重組蛋白并使用該重組蛋白免疫新西蘭兔制備多克隆抗體，效價為1：51200。利用多克隆

4、抗體對家蠶UBRPS27a進行亞細胞定位，結果顯示細胞核與細胞質(zhì)中都有分布。同時還進行了熒光定量：PCR分析不同組織、時期該基因的表達差異，定量內(nèi)參選用18srRNA，結果表明在各組織中，脂肪體和腸中的表達量最低，絲腺中表達量最高；在卵、幼蟲、蛹和蛾四個發(fā)育時期中，蛹的表達量最高，卵和幼蟲中表達量較低。我們合成了BmUBRPS27a的dsRNA進行RNAi，用脂質(zhì)體轉(zhuǎn)染家蠶卵巢上皮細胞：Bm5后，發(fā)現(xiàn)了細胞的形態(tài)發(fā)生了變化：細胞由圓形、