家蠶低分子量熱激蛋白基因克隆、表達(dá)及功能研究.pdf

1、家蠶是人類利用較早的昆蟲(chóng)，它既是重要的經(jīng)濟(jì)昆蟲(chóng)，也是重要的模式生物。低分子量熱激蛋白 (small heat shockproteins,sHSPs) 是一種在生物界普遍存在的蛋白質(zhì)，sHSPs不僅在應(yīng)激條件下高效表達(dá)，在正常狀態(tài)的細(xì)胞中也廣泛存在<'[1]>，參與一些重要的細(xì)胞生理活動(dòng)。sHSPs的生物功能<'[2]>是多樣化的，可增強(qiáng)細(xì)胞對(duì)逆境的耐受能力和恢復(fù)能力，充當(dāng)分子伴侶；近來(lái)的研究還表明，sHsPs還與生物的正常生長(zhǎng)、發(fā)育與

2、分化、細(xì)胞內(nèi)信號(hào)傳導(dǎo)和育性轉(zhuǎn)化有關(guān)<'[3，4]>。不同物種sHSPs在序列和大小上存在很大的差異，但他們都有一個(gè)保守的α-晶體結(jié)構(gòu)域<'[5]>。為了系統(tǒng)的研究家蠶sHSPs基因的分布特點(diǎn)、基因結(jié)構(gòu)、表達(dá)特性以及sHSPs功能等。本研究基于家蠶基因組數(shù)據(jù)對(duì)家蠶sHSPs基因進(jìn)行系統(tǒng)的分析，克隆家蠶sHSPs基因，進(jìn)行體外表達(dá)并鑒定sHSPs蛋白功能。研究結(jié)果如下： 1 家蠶sHSPs基因的生物信息學(xué)分析通過(guò)生物信息學(xué)分析方法，

3、在家蠶基因組中一共找到14個(gè)sHSPs基因，6個(gè)基因與已知的家蠶sHSPs基因序列相同，8個(gè)是新發(fā)現(xiàn)基因。14個(gè)sHSPs基因中只有3個(gè)基因含有內(nèi)含子結(jié)構(gòu)，其中Bmhsp21.4基因含有4個(gè)內(nèi)含子，Bmhsp34.8和Bmhsp26.3各含有2個(gè)內(nèi)含子。根據(jù)sHSPs基因在家蠶基因組序列中的分布位置，其分布表現(xiàn)出串聯(lián)重復(fù)的特點(diǎn)。14個(gè)家蠶sHSPs預(yù)測(cè)的蛋白序列都具有相似性較高的α-晶體結(jié)構(gòu)域，而N-端和C-端序列的相似性都較低，α-晶

4、體蛋白功能區(qū)長(zhǎng)短不一，長(zhǎng)度約60～90個(gè)氨基酸殘基。 2 家蠶sHSPs基因表達(dá)特性EST數(shù)據(jù)分析和基因芯片結(jié)果表明：家蠶sHSPs基因在家蠶正常生長(zhǎng)發(fā)育過(guò)程中都存在表達(dá)，BmsHSPs基因在組織間存在4種表達(dá)方式和在蛹蛾時(shí)期存在3種表達(dá)方式。兒乎所有BmsHSPs基因在生殖腺中高表并且雌雄差異明顯。 熱刺激實(shí)驗(yàn)結(jié)果表明BmsHSPs基因在非脅迫條件下存在一定的表達(dá)量，并且伴隨著家蠶生長(zhǎng)發(fā)育的全過(guò)程，但在熱刺激脅迫下Bm

5、sHSPs基因的表達(dá)量大大提高，表明熱刺激脅迫下蠶體能作出應(yīng)激反應(yīng)。 3 家蠶低分子量熱激蛋白基因的克隆以及家蠶sHSPs系統(tǒng)進(jìn)化分析根據(jù)家蠶基因組的CDS序列設(shè)計(jì)引物，克隆5個(gè)sHSPs基因，通過(guò)測(cè)序驗(yàn)證，克隆所得到5個(gè)sHSPs基因的核苷酸序列與家蠶基因組中這幾個(gè)基因的堿基序列一致，沒(méi)有任何堿基變化。 將人類、鼠、果蠅和家蠶4個(gè)物種的sHSPs蛋白序歹lj構(gòu)建系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)，從系統(tǒng)發(fā)生樹(shù)可以看出，鱗翅目和雙翅目所編碼的低

6、分子量熱激蛋白分別聚成一類并形成顯著相關(guān)的群體，類群中的基因是在物種分化以后通過(guò)基因的復(fù)制形成的；其中有趣的是，少數(shù)sHSPs在物種間具有較物種內(nèi)更高的相似性，如Bmhsp21.4與果蠅CG14207-PA以及Bmhsp26.3與果蠅CG4533-PA，這些基因序列間具有很高的同源性，結(jié)構(gòu)保守，可能鱗翅目和雙翅目物種分化前就已經(jīng)存在。進(jìn)化分析表明，家蠶sHSPs的進(jìn)化關(guān)系與物種的進(jìn)化關(guān)系大體一致。 4 重組表達(dá)質(zhì)粒的構(gòu)建以及pE

7、T-50b-Bmhsp24.3質(zhì)粒的誘導(dǎo)表達(dá)以pET-50b(+)為表達(dá)載體，將Bmhsp24.3基因整個(gè)編碼區(qū)亞克隆到pET-50b(+)表達(dá)載體構(gòu)建成重組表達(dá)質(zhì)粒，轉(zhuǎn)化到BL21表達(dá)菌株，通過(guò)IPTG誘導(dǎo)重組質(zhì)粒pET-50b-Bmhsp24.3表達(dá)蛋白。在一般的誘導(dǎo)表達(dá)條件下(37℃、IPTG終濃度為1mM、培養(yǎng)6h)，誘導(dǎo)表達(dá)蛋白以包涵體形式存在，改變誘導(dǎo)表達(dá)條件(18℃， IPTG終濃度為0.25mM、過(guò)夜培養(yǎng))，同樣得到誘導(dǎo)

8、表達(dá)蛋白。經(jīng)蛋白組分鑒定發(fā)現(xiàn)，誘導(dǎo)表達(dá)的重組蛋白以可溶和不溶的形式存在，并且兩者各占細(xì)胞總蛋白的50％，有利于對(duì)重組蛋白功能的研究。 5 重組蛋白Western blot檢測(cè)及功能研究誘導(dǎo)表達(dá)蛋白產(chǎn)物經(jīng)SDS-PAGE分析表明，重組蛋白BmHSP24.3表達(dá)產(chǎn)物的分子量為80kDa左右，與用生物信息學(xué)方法預(yù)測(cè)得到的結(jié)果非常吻合。Westem blot檢測(cè)結(jié)果表明，重組蛋白與抗體有較強(qiáng)的特異性反應(yīng)。 在高溫條件下，重組蛋白