顆粒溶素與穿孔素的表達(dá)及其對(duì)肺癌細(xì)胞影響的研究.pdf

1、顆粒溶素(Granulysin,GNLY)和穿孔素(Perforin,PFP)是存在于NK細(xì)胞和CTL細(xì)胞中的細(xì)胞毒蛋白,廣泛參與機(jī)體抗病原微生物感染和抗腫瘤免疫,有望成為理想的抗腫瘤、抗結(jié)核藥物。顆粒溶素和穿孔素的表達(dá)與癌癥、感染、器官移植等多種疾病都有密切關(guān)系,深入進(jìn)行顆粒溶素和穿孔素的研究對(duì)許多重大疾病的診斷及治療都有非常重要的意義。本實(shí)驗(yàn)運(yùn)用基因工程的方法體外獲取顆粒溶素和穿孔素基因片段,利用原核表達(dá)體系合成不同分子量的顆粒溶素

2、融合蛋白,為顆粒溶素的后續(xù)研究創(chuàng)造條件；構(gòu)建顆粒溶素和穿孔素真核共表達(dá)載體并轉(zhuǎn)染人肺腺癌A549細(xì)胞,體外觀察顆粒溶素和穿孔素在肺癌細(xì)胞中的表達(dá)情況,為進(jìn)一步探索顆粒溶素和穿孔素在腫瘤治療中的應(yīng)用提供依據(jù)。
　　 主要研究方法及結(jié)果:
　　 1.體外分離并培養(yǎng)外周血單個(gè)核細(xì)胞,抽提總RNA,RT-PCR擴(kuò)增人顆粒溶素和穿孔素基因片段,將其插入pMD18-T構(gòu)建克隆載體,測(cè)序結(jié)果表明人顆粒溶素和穿孔素基因片段與Genban

3、k中序列一致,構(gòu)建了pMD-GNLY和pMD-PFP。
　　 2.構(gòu)建原核表達(dá)質(zhì)粒pET-GNLY9K和pET-GNLY15K,將重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)入大腸桿菌Rosetta(DE3),經(jīng)IPTG誘導(dǎo)在原核表達(dá)系統(tǒng)中高效表達(dá)了相應(yīng)分子質(zhì)量約為31和37kD的融合蛋白,Western-blotting結(jié)果表明重組顆粒溶素融合蛋白能與羊抗人顆粒溶素抗體發(fā)生良好的抗原抗體反應(yīng)。
　　 3.以FMDV2A代替IRES,構(gòu)建真核共表達(dá)載體p

4、GNLY-2A-PFP并轉(zhuǎn)染人肺癌A549細(xì)胞,RT-PCR和間接免疫熒光檢測(cè)目的蛋白表達(dá),流式細(xì)胞AnnexinV/PI檢測(cè)轉(zhuǎn)染后細(xì)胞凋亡情況。重組質(zhì)粒轉(zhuǎn)染A549細(xì)胞后檢測(cè)出了目的基因mRNA及蛋白的表達(dá),pGNLY-2A-PFP轉(zhuǎn)染后細(xì)胞死亡率高于其他對(duì)照組(P<0.05),死亡細(xì)胞以凋亡為主。
　　 結(jié)論及研究意義:
　　 1.成功獲取了顆粒溶素和穿孔素基因片段,為顆粒溶素和穿孔素的后續(xù)研究創(chuàng)造了條件。