Hsa-microRNA-218與顆粒溶素表達(dá)關(guān)系的探討.pdf

1、目的：
　　將顆粒溶素（Granulysin,GLS）表達(dá)質(zhì)粒與microRNA（miRNA）干擾質(zhì)粒共轉(zhuǎn)染入293T細(xì)胞中，在細(xì)胞層面上觀察hsa-microRNA-218(miR-218)對GLS蛋白表達(dá)的干擾效果；應(yīng)用Taqman探針、qRT-PCR檢測miR-218在結(jié)核?。═uberculosis,TB）人血清、血漿中的表達(dá)情況，為進(jìn)一步探討miR-218作為TB檢測生物標(biāo)志物在診斷結(jié)核分枝桿菌（Mycobacteriu

2、m tuberculosis,MTB）感染的應(yīng)用方面提供方法和實驗基礎(chǔ)；運用流式細(xì)胞術(shù)（Flow cytometry，F(xiàn)CM）從外周血中篩選出CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，用LV3-miR-218等包裝慢病毒感染后，Western-blot探討miR-218和GLS表達(dá)間的關(guān)系。
　　方法：
　　1.抽提佛波酯（phorbol12-myristate13-acetatefor,PMA）激活的THP-1細(xì)胞的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄

3、后PCR擴(kuò)增GLS基因，將其克隆至pDsRed-Express-C1，構(gòu)建GLS表達(dá)質(zhì)粒pDsRed-GLS。將pDsRed-GLS與pGenesil-miR-218（pGenesil-miR-control）共轉(zhuǎn)染293 T細(xì)胞，36h后激光共聚焦顯微鏡觀察兩種質(zhì)粒在細(xì)胞中的表達(dá)情況，48h后提取細(xì)胞總RNA和蛋白，RT-PCR和Western Blot檢測miR-218對GLS表達(dá)的影響。
　　2.設(shè)計miR-218及內(nèi)參U6

4、 snRNA特異性逆轉(zhuǎn)錄引物及Taqman探針，抽提TB患者和健康人群對照組血清、血漿標(biāo)本中的總RNA，逆轉(zhuǎn)錄反應(yīng)后，運用qRT-PCR檢測miR-218的表達(dá)情況。同時比較miRNA專用提取試劑盒和TRIzol試劑在TB血清、血漿中抽提miR-218的效率；miR-218在TB血清和血漿中的含量；血清標(biāo)本經(jīng)預(yù)熱處理和10％SDS溶液預(yù)處理對抽提miR-218的影響。
　　3.運用FCM從TB患者和健康人群的外周血中分選出CD4+

5、T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞，比較兩種細(xì)胞的比例和比值變化；qRT-PCR檢測miR-218在外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)情況；慢病毒LV3-miR-218/LV3-miR-control、LV10-miR-218 inhibitor/LV10-miR-control inhibitor感染CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞后，Western-blot探討miR-218和GLS表達(dá)間的關(guān)系。
　　結(jié)果：
　　1.酶切和

6、測序結(jié)果證實重組質(zhì)粒pDsRed-GLS構(gòu)建成功，且能與miRNA干擾質(zhì)粒在293 T細(xì)胞中共表達(dá)。與轉(zhuǎn)染pGenesil-miR-control組細(xì)胞相比，Western-Blot結(jié)果顯示轉(zhuǎn)染pGenesil-miR-218組細(xì)胞的GLS蛋白表達(dá)下降約50%（P<0.05），而GLS mRNA表達(dá)則無明顯變化（P>0.05）。
　　2. MiR-218在血清、血漿中都是穩(wěn)定存在的，可以被檢測出；miR-218在TB患者體內(nèi)的表達(dá)

7、量是顯著升高的（P<0.05），相較于血清，它在血漿中的含量更為豐富(P<0.05)；miRNA專用提取試劑盒提取miR-218的效率高于TRIzol試劑（P<0.05）；對TB患者血清標(biāo)本進(jìn)行預(yù)熱或10%SDS溶液預(yù)處理后都能很好地提高抽提miR-218的效率，降低qRT-PCR檢測時的CT值（P<0.05），兩種處理方法相比較，并無明顯差異（P>0.05）。
　　3.相較于健康人群，TB患者外周血中CD4+T細(xì)胞的比例降低（P

8、<0.05），CD8+T細(xì)胞的比例增高（P<0.05），CD4+T細(xì)胞與CD8+T細(xì)胞的比值下降（P<0.05）；miR-218在TB患者外周血CD4+T細(xì)胞、CD8+T細(xì)胞中的表達(dá)同健康人群對照組相比，沒有顯著的統(tǒng)計學(xué)意義（P>0.05）。
　　結(jié)論：
　　1.MiR-218在轉(zhuǎn)錄后水平干擾了GLS的表達(dá)。
　　2.MiR-218在TB患者體內(nèi)表達(dá)量顯著升高；Taqman探針結(jié)qRT-PCR技術(shù)適用于檢測TB血清、血