多西環(huán)素對肺癌細胞的作用及其機制的研究.pdf

1、目的與意義： 隨著對基質(zhì)金屬蛋白酶（MMPs）認識的深入，MMPs在腫瘤生長、侵襲、轉(zhuǎn)移中的作用越來越引起人們的重視。目前, 應(yīng)用MMPs抑制劑治療腫瘤已成為腫瘤研究的新方向。多西環(huán)素（DOX，一種半合成四環(huán)素族抗生素）是MMPs 抑制劑的一種，因其毒性小、半衰期長而研究較為廣泛。 本課題通過研究DOX對肺癌A549細胞生長、侵襲、轉(zhuǎn)移特性的影響及相關(guān)機制的研究，為肺癌的治療提供一個新的方法與手段。 方法：

2、 應(yīng)用MTT比色法觀察DOX 對A549細胞體外增殖的影響；應(yīng)用透射電鏡、熒光顯微鏡、DNA瓊脂糖凝膠電泳、流式細胞儀研究DOX 對A549細胞的促凋亡作用；通過細胞體外粘附試驗、劃痕試驗、侵襲試驗、裸鼠人工肺轉(zhuǎn)移模型等的方法研究DOX 對A549細胞的粘附、侵襲和移動力可能存在的作用；通過明膠底物SDS－PAGE凝膠電泳、RT-PCR、Western Blot觀察DOX 對明膠酶活性、表達的影響；應(yīng)用免疫組化的方法觀察DOX 對A

3、549細胞VEGF表達的影響。并應(yīng)用RT-PCR、Western Blot觀察DOX 對c-fos, c-junmRNA及蛋白表達的影響。 結(jié)果： 1. 5 mg/L以上的DOX可以抑制A549細胞增殖(P < 0.01)，該抑制作用呈時間劑量依賴效應(yīng)。而2.5mg/L的DOX 作用不著(P > 0.05)。 2. 20、40mg/L的DOX作用48h后，電鏡及熒光顯微鏡顯示：A549細胞出現(xiàn)體積縮小，染色質(zhì)

4、邊集，凋亡小體形成等細胞凋亡現(xiàn)象；DNA瓊脂糖凝膠電泳出現(xiàn)典型的梯狀條帶，DOX劑量越大，條帶越明顯；AnnexinV-PI雙染顯示：0、10、20、40mg/L DOX作用后，細胞凋亡率分別為2．22％、5．86％、12．6％、20．59％。 3. 2.5、5、10mg/L的DOX作用48h后，其粘附率分別為81.6％、67.2％、55.3％，而對照組為96％。作用24h后，2.5、5、10mg/L的DOX對A549細胞在M

5、atrigel上的移動抑制率分別為3.7％、10.8％、18.2％；作用48h后，其移動抑制率分別為5.8％、20.2％、35.8％；5、10mg/L的DOX可以抑制A549細胞在Matrigel上侵襲，其侵襲抑制率分別為12％、33％，而2.5 mg/L DOX對其無明顯影響（P>0.05）。應(yīng)用30mg/kg/dDOX處理的裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)顯著低于對照組。DOX組和對照組裸鼠肺表面轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)數(shù)分別為74±19個和15±35個，其轉(zhuǎn)

6、移抑制率達79％。 4. 2.5、5、10mg/L的DOX均可不同程度的抑制A549細胞基質(zhì)金屬蛋白酶2（MMP2）的活性，在10mg/L時尤為顯著。10mg/L的DOX可抑制A549細胞MMP2的mRNA合成及蛋白表達。 5．10mg/L的DOX體外可以抑制A549細胞血管內(nèi)皮生長因子（Vacularendothelial growth factor, VEGF）的表達。應(yīng)用30mg/kg/dDOX處理的裸鼠肺轉(zhuǎn)移

7、瘤中VEGF的表達明顯低于對照組。 6．10mg/L的DOX可以抑制A549細胞c-jun mRNA及蛋白表達。 結(jié)論: 1．藥用劑量DOX可以抑制A549細胞體外增殖，大劑量可促其凋亡； 2．藥用劑量的DOX即可抑制A549細胞對細胞外基質(zhì)Matrigel的粘附、移動及侵襲；安全劑量DOX可減少裸鼠肺轉(zhuǎn)移瘤結(jié)節(jié)形成； 3．藥用劑量的DOX可以抑制A549細胞MMP2的活性、表達；DOX抑制A