Prox1在肺癌細胞中的作用機制研究.pdf

1、前言:
　　 肺癌是最常見的肺部原發(fā)性惡性腫瘤,世界各國,特別是工業(yè)發(fā)達的國家,肺癌的發(fā)病率和死亡率均迅速上升,目前排名世界癌癥死因第一名。肺癌的發(fā)病機制和病因亦成為人們研究的熱點。轉錄因子Proxl是一種果蠅prospero同源基因,人類.Proxl基因位于人染色體1q32.2～1q32.3,長度約為58kb,至少含有5個外顯子,編碼83kD蛋白,在細胞發(fā)育分化及機體器官形成過程中起關鍵性作用,在正常胚胎眼晶體、肝臟、神經元發(fā)

2、育過程中Prox1的地位至關重要。
　　 轉錄因子Prox1是淋巴管生成最基本的調控因子,是淋巴管內皮細胞的特異性標記物,基因剔除Prox1后淋巴管生成受阻。血管內皮異位表達prox1可誘導淋巴特異基因表達。此前有研究顯示在腸道腫瘤中轉錄因子Prox1表達與腫瘤分化程度有關。Prox1表達高的腫瘤預后更加不良,體外RNA干擾特異性敲除Proxl基因使細胞增殖明顯減少,而過表達Prox1則可明顯的促進腫瘤增殖。
　　 本實

3、驗通過檢測Prox1在肺癌細胞系中的表達情況,分析Prox1在肺癌侵襲轉移過程中所發(fā)揮的作用。通過轉染正義和反義Prox1,檢測肺癌侵襲和遷移活動能力的變化。結果顯示:Prox1在非小細胞肺癌的細胞核和細胞漿共表達,而在小細胞肺癌細胞中主要在核表達,并呈強陽性。Prox1表達增加時能促進肺癌侵襲遷移,表達減少時侵襲遷移作用受到抑制,并且Prox1表達變化時Rho蛋白表達水平也隨之變化,Prox1表達和RhoA,RhoC表達呈正相關,和R

4、hoB表達呈負相關,由于Rho蛋白在調節(jié)細胞骨架,粘附和侵襲遷移運動中起到一定作用,因此我們推測,轉錄因子Prox1促進肺癌的遷移和侵襲有可能是通過Rho蛋白發(fā)揮作用的,并且Prox1參與調節(jié)RhoB,RhoC的轉錄活性。與此同時,Prox1還有可能促進肺癌細胞的增殖能力,其相關機制仍需深入討論。
　　 材料與方法:
　　 1、主要材料與試劑:
　　 細胞系:人肺腺癌細胞系A549,人小細胞肺癌細胞系H446

5、r>　　 主要抗體:Prox1antibody:英國ABCAM公司rabbitpolyclonal;RhoA,RhoB,RhoCantibodies:美國PROTEINTECH公司rabbitpolyclonal;CyclinA,CyclinB1,CyclinD1antibodies:美國CellSignaling
　　 相關試劑:
　　 Trizol試劑購自lnvitrogen公司,RT-PCR試劑盒購自北京全式金生

6、物技術有限公司,realtime-PCR試劑盒購自TAKARA公司,Transweli小室購自美國ComingCostar公司,Matrigel基質膠購于BD公司,轉染試劑:HiPerFectTransfectionReagent和AttracteneTransfectionReagent購自德國QIAGEN公司,CHIPassaykit:Beyotime,Beijing
　　 2、實驗方法:
　　 (1)細胞培養(yǎng)

7、>　　 將A549,H446細胞在含有10%胎牛血清的DMEM和1640培養(yǎng)基37℃,5%CO2孵箱孵育,1-2d換新鮮培養(yǎng)液。當細胞長滿瓶底后,用0.25%胰酶消化,進行傳代。
　　 (2)瞬時轉染
　　 細胞培養(yǎng)后按照QIANGENE實驗說明步驟進行
　　 (3)westemblot雜交
　　 (4)提取細胞總RNA
　　 (5)RT-PCR:根據北京TRANSGENG試劑盒步驟RT-PCR

8、
　　 (6)realtime-PCR:大連TAKARA公司qPCR試劑盒
　　 (7)Transwell遷移實驗
　　 (8)劃痕試驗
　　 (9)Transwell侵襲實驗
　　 (10)細胞集落形成實驗
　　 (11)染色質免疫共沉淀:按照Beyotime試劑盒步驟進行,RT-PCR檢測結果。
　　 (12)統(tǒng)計分析
　　 結果:
　　 1、Prox1調節(jié)肺癌

9、細胞增殖；
　　 2、Prox1表達與肺癌細胞的遷移和侵襲能力相關；
　　 3、Prox1表達與Rho蛋白相關。
　　 結論:
　　 1、轉錄因子Prox1促進肺癌細胞增殖;
　　 2、Prox1與肺癌細胞的侵襲遷移能力相關,Prox1表達上調促進肺癌細胞的侵襲和遷移,下調Prox1抑制肺癌細胞的侵襲和遷移;
　　 3、Prox1表達與Rho蛋白相關,Prox1表達與RhoA,RhoC正相