RKIP在胃癌細(xì)胞中的作用及其機(jī)制的研究.pdf

1、本文主要從以下幾個部分展開論述：
　　第一部分 RKIP通過microRNA-224調(diào)控抑制胃癌細(xì)胞增殖遷移，促進(jìn)凋亡
　　目的:胃癌的發(fā)病率居惡性腫瘤的第四位，死亡率居第二位，是最常見的惡性腫瘤之一。而胃癌患者的5年生存率并不高，要改變目前的狀態(tài)，闡明其發(fā)病機(jī)制顯得尤為重要。胃癌的發(fā)生與腸上皮化生、慢性萎縮性胃炎、不典型增生等癌前病變密切相關(guān)，涉及多種基因的異常。而miRNA在其過程中起重要作用，miRNA能在轉(zhuǎn)錄后水平調(diào)

2、控各種關(guān)鍵基因。Raf激酶抑制蛋白(RKIP)是磷脂酰乙醇胺結(jié)合蛋白(PEBP)家族成員之一。本研究檢測RKIP在人胃癌細(xì)胞中的表達(dá)情況，和對胃癌細(xì)胞SGC-7901生物學(xué)特性的影響，并觀察microRNA-224(miR-224)對靶基因RKIP表達(dá)調(diào)控作用，為胃癌治療提供新的治療方法和策略。
　　方法:定量實(shí)時PCR檢測RKIP在胃癌細(xì)胞系(SGC-7901、MGC80-3、 MKN45)中的表達(dá)情況。構(gòu)建RKIP真核表達(dá)載體

3、pcDNA3.1-RKIP，并在SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RKIP48h后，用Western blot檢測SGC-7901細(xì)胞中RKIP蛋白表達(dá)變化;MTT檢測RKIP過表達(dá)對SGC-7901細(xì)胞活力的影響。流式細(xì)胞儀分析RKIP過表達(dá)對SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡的影響。采用transwell侵襲小室實(shí)驗(yàn)方法檢測RKIP過表達(dá)對SGC-7901細(xì)胞遷移的影響。利用熒光報告酶系統(tǒng)檢驗(yàn)RKIP是miR-224調(diào)控靶基因

4、，并采用Western blot方法檢測miR-224對細(xì)胞中RKIP蛋白表達(dá)的影響。利用MTT，流式細(xì)胞儀和transwell侵襲小室檢測miR-224對RKIP生物學(xué)特性的調(diào)控作用。
　　結(jié)果:定量實(shí)時PCR顯示:RKIP在胃癌細(xì)胞系較正常胃粘膜上皮細(xì)胞系中的表達(dá)呈下降趨勢(p＜0.01)。在SGC-7901中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RKIP48h后，細(xì)胞中RKIP的表達(dá)與對照組相比顯著上升(p＜0.01)。MTT，流式細(xì)胞儀和

5、transwell侵襲小室檢測結(jié)果顯示:在SGC-7901細(xì)胞中過表達(dá)RKIP后，細(xì)胞凋亡數(shù)增加(p＜0.01)，細(xì)胞活力和S期細(xì)胞比例下降（p＜0.05），穿過transwell小室的細(xì)胞數(shù)降低（p＜0.05）。熒光素酶報告基因系統(tǒng)的檢測結(jié)果:與對照組相比，經(jīng)轉(zhuǎn)染miR-224 mimic組的熒光素酶活力顯著降低(p＜0.05）。用Western blot檢測的結(jié)果顯示:與非轉(zhuǎn)染組相比，SGC-7901轉(zhuǎn)染miR-224 mimic4

6、8h后，細(xì)胞中RKIP蛋白的表達(dá)量顯著下降(p＜0.05）。MTT，流式細(xì)胞儀和transwell侵襲小室檢測結(jié)果顯示:在SGC-7901中轉(zhuǎn)染miR-224 mimic后，可抑制因過表達(dá)RKIP后導(dǎo)致的細(xì)胞生物學(xué)特性的改變。
　　結(jié)論:RKIP在人胃癌細(xì)胞系表達(dá)下調(diào)，miR-224可負(fù)調(diào)節(jié)RKIP蛋白的表達(dá)，進(jìn)而促進(jìn)腫瘤的活性，RKIP可抑制胃癌細(xì)胞的增殖和侵襲。增強(qiáng)RKIP表達(dá)的治療策略有望使胃癌患者受益。
　　第二部分

7、 RKIP通過NF-κB/Snail信號通路促進(jìn)順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞的死亡
　　目的:胃癌化療的有效率因化療耐藥而明顯受限，多數(shù)研究者認(rèn)為腫瘤細(xì)胞的凋亡程度是化療療效判定的重要指標(biāo)，腫瘤細(xì)胞的凋亡與化療藥物的療效呈時間、劑量的依賴關(guān)系。2013年Martinho O等研究報道了RKIP與子宮頸癌的順鉑化療敏感性相關(guān)。順鉑是目前胃癌術(shù)后輔助化療及術(shù)前新輔助化療中最常用的藥物之一，也是目前利用體外培養(yǎng)胃癌組織進(jìn)行藥敏實(shí)驗(yàn)的常用藥物。研究

8、表明順鉑可以通過結(jié)合DNA形成交聯(lián)進(jìn)而抑制DNA合成，抑制細(xì)胞分裂，最終誘導(dǎo)細(xì)胞凋亡，但腫瘤細(xì)胞耐藥性的存在，極大地降低了順鉑的療效。本研究通過檢測RKIP在人胃癌細(xì)胞系SGC-7901中以及順鉑耐藥的細(xì)胞株SGC-7901/DDP中表達(dá)的情況，探討RKIP在胃癌細(xì)胞中對順鉑化療敏感性的關(guān)系以及其作用的信號通路，為胃癌的治療提供新的方法和策略。
　　方法:分別體外培養(yǎng)人胃癌細(xì)胞系SGC-7901及順鉑的耐藥細(xì)胞株SGC-7901/

9、DDP，用Western blot檢測RKIP蛋白在兩種細(xì)胞中表達(dá)的情況。用轉(zhuǎn)染RKIP siRNA的胃癌細(xì)胞SGC-7901，經(jīng)培養(yǎng)48h后，Western blot檢測轉(zhuǎn)染后細(xì)胞中RKIP蛋白表達(dá)量的變化，用MTT檢測經(jīng)轉(zhuǎn)染RKIP siRNA的胃癌細(xì)胞細(xì)胞活力的變化，以及用MTT和流式細(xì)胞儀檢測RKIP的異位表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)的耐藥胃癌細(xì)胞活力和對細(xì)胞凋亡的影響。采用Western blot方法檢測RKIP異位表達(dá)對順鉑誘導(dǎo)的胃癌細(xì)胞

10、中NF-κB和Snail表達(dá)的影響。
　　結(jié)果:Western blot檢測結(jié)果表明:RKIP在順鉑耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP中的表達(dá)量較胃癌細(xì)胞SGC-7901明顯下降(p＜0.05）。與對照組相比，在SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RKIP siRNA48h后，細(xì)胞中RKIP的表達(dá)顯著下降(p＜0.01)。MTT檢測結(jié)果顯示:在SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RKIP siRNA后，細(xì)胞活力明顯上升(p＜0.05），在SGC-79

11、01/DDP細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RKIP重組表達(dá)質(zhì)粒后，細(xì)胞的活力明顯下降(p＜0.05）。流式細(xì)胞儀和MTT的結(jié)果顯示:胃癌細(xì)胞SGC-7901抑制RKIP表達(dá)后，即使在順鉑作用下，腫瘤細(xì)胞凋亡的數(shù)量明顯減少(p＜0.05），細(xì)胞的活力也明顯上升(p＜0.05）;順鉑的耐藥細(xì)胞株SGC-7901/DDP細(xì)胞過表達(dá)RKIP后，即使在順鉑作用下，細(xì)胞的凋亡也顯著增加(p＜0.05），細(xì)胞的活力下降(p＜0.05）。Western blot檢測結(jié)果顯

12、示:在SGC-7901細(xì)胞中，抑制RKIP的表達(dá)，可明顯促進(jìn)NF-κB表達(dá)的升高(p＜0.05）;而在SGC-7901/DDP細(xì)胞中，促進(jìn)RKIP的表達(dá)，可明顯抑制Snail的表達(dá)(p＜0.05）。
　　結(jié)論:RKIP蛋白在SGC-7901/DDP細(xì)胞株中表達(dá)下調(diào)，過表達(dá)RKIP可使胃癌細(xì)胞對順鉑的敏感性增強(qiáng)，其作用機(jī)制可能是通過NF-κB/Snail信號通路。
　　第三部分 RKIP通過調(diào)控HMGA2和OPN的表達(dá)來抑制胃

13、癌細(xì)胞的存活和遷移
　　目的:高遷移率族蛋白A2(HMGA2)，在多種惡性腫瘤中發(fā)揮重要作用。Sugiko等發(fā)現(xiàn)，在人類胰腺癌中，HMGA2是MEK的間接靶基因，可以與Snaill基因啟動子區(qū)域結(jié)合，抑制E-cadherin的轉(zhuǎn)錄，從而促進(jìn)了胰腺癌細(xì)胞上皮間質(zhì)轉(zhuǎn)化。關(guān)于RKIP抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和促進(jìn)凋亡的機(jī)制，已有的研究顯示，HMGA2是MEK的間接靶基因，由此推斷，RKIP可能通過抑制MEK的活化來抑制HMGA2的生物學(xué)作

14、用，從而發(fā)揮其抑制胃癌細(xì)胞增殖、侵襲和促進(jìn)凋亡的生物學(xué)作用。本研究探討RKIP抑制胃癌細(xì)胞存活，侵襲和促進(jìn)凋亡的機(jī)制，為RKIP應(yīng)用于胃癌治療提供理論依據(jù)。
　　方法:構(gòu)建RKIP和HMGA2重組表達(dá)質(zhì)粒pcDNA3.1-RKIP和pcDNA3.1-HMGA2，利用脂質(zhì)體將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-RKIP或RKIP-shRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞中，實(shí)時定量PCR或Western blot檢測RKIP在SGC-7

15、901細(xì)胞中異位表達(dá)后，細(xì)胞中RKIP、HMGA2和OPN mRNA和蛋白表達(dá)變化。將重組質(zhì)粒pcDNA3.1-HMGA2或HMGA2-shRNA轉(zhuǎn)染進(jìn)胃癌細(xì)胞系SGC-7901細(xì)胞后，Western blot檢測HMGA2在SGC-7901細(xì)胞中表達(dá)變化。并利用流式細(xì)胞儀和transwell分析法檢測，在胃癌細(xì)胞SGC-7901中異位表達(dá)HMGA2后，HMGA2對SGC-7901細(xì)胞的增殖、凋亡和侵襲的影響。為了進(jìn)一步探討RKIP對H

16、MGA2生物活性的調(diào)控作用，在SGC-7901細(xì)胞中同時過表達(dá)RKIP和HMGA2，或同時干擾RKIP和HMGA2，并利用流式細(xì)胞儀和transwell分析法檢測其對SGC-7901細(xì)胞增殖、凋亡和侵襲的影響。
　　結(jié)果:實(shí)時定量PCR和Western blot檢測結(jié)果顯示:在SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-RKIP后，RKIP mRNA和蛋白表達(dá)顯著增高(p＜0.01），而HMGA2和OPN mRNA和蛋白表達(dá)則顯著

17、降低(p＜0.01);而在SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染RKIP-shRNA后，結(jié)果則相反。在SGC-7901細(xì)胞中轉(zhuǎn)染pcDNA3.1-HMGA2后，細(xì)胞中HMGA2蛋白表達(dá)顯著增高(p＜0.01），而細(xì)胞中轉(zhuǎn)染HMGA2-shRNA后，HMGA2蛋白表達(dá)顯著降低(p＜0.01)。流式細(xì)胞儀和transwell分析結(jié)果顯示:在SGC-7901細(xì)胞中，過表達(dá)HMGA2后，細(xì)胞(G2+S)比例[(G2+S) phase fraction]顯著