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文檔簡介
1、背景:
胃癌是人類常見的惡性腫瘤之一,國際癌癥研究協(xié)會最新數(shù)據(jù)顯示其發(fā)病率及死亡率高居惡性腫瘤前列。胃癌細(xì)胞增殖失控、侵襲、轉(zhuǎn)移及耐藥是導(dǎo)致其不良預(yù)后的重要原因。胃癌治療的突破依賴于我們對胃癌發(fā)生發(fā)展復(fù)雜分子機制的深入探索?!胺强煽匦匝装Y”在胃癌的發(fā)生發(fā)展進(jìn)程中扮演著重要角色,在炎癥與腫瘤動態(tài)網(wǎng)絡(luò)的可調(diào)性與魯棒性(robustness)辯證關(guān)系中,趨化因子受體與其配體是一類重要的非可控性炎癥因素。最近有研究發(fā)現(xiàn),趨化因子受體家
2、族在數(shù)種腫瘤細(xì)胞中高表達(dá),在腫瘤的發(fā)生、增殖、生長、侵襲、轉(zhuǎn)移、血管新生及耐藥等方面發(fā)揮重要的調(diào)控作用。
CXCR1/2即CXCR1和CXCR2,二者具有75.8%的高度相似序列,屬于趨化因子受體家族。最初研究表明CXCR1/2主要表達(dá)于中性粒細(xì)胞,被激活后調(diào)節(jié)信號通路下游的蛋白靶點(如NF-kB,AP-1,MMP9等),參與化學(xué)趨化、鈣離子流動、細(xì)胞增殖、運動及血管新生的調(diào)節(jié)等。目前,有研究顯示CXCR1/2在某些腫瘤進(jìn)程中
3、發(fā)揮一定的作用。而有關(guān)CXCR1/2在胃癌增殖生長、侵襲及轉(zhuǎn)移中扮演何種角色?許多的研究表明MAPK/ERK和PI3K/AKT通路參與調(diào)控腫瘤的生物學(xué)行為,CXCR1/2是否與MAPK/ERK和PI3K/AKT通路在胃癌調(diào)控中有關(guān)聯(lián)?哪些與胃癌細(xì)胞凋亡、增殖生長及侵襲轉(zhuǎn)移相關(guān)的指標(biāo)參與到CXCR1/2調(diào)控通路中?這些問題值得但尚未被深入研究。
目的:
本課題著眼于一類重要的非可控性炎癥因素——趨化因子受體CXCR1/
4、2:
1.研究CXCR1/2在胃癌中的表達(dá)及其與臨床病理特征的關(guān)系。
2.探究靶向阻斷CXCR1/2和CXCR1基因沉默及過表達(dá)對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及其機制。
3.為利用CXCR1/2設(shè)計靶向藥物治療胃癌提供有價值的實驗基礎(chǔ)。
方法:
1.探討CXCR/2表達(dá)與臨床病理特征及與調(diào)控胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為相關(guān)指標(biāo)的相關(guān)性
(1)收集胃癌及癌旁組織標(biāo)本69例,采用免疫組織化學(xué)方法
5、(IHC)檢測,并分析CXCR1/2表達(dá)與臨床病理特征之間的相關(guān)性;
(2)分析CXCR1/2表達(dá)與ERK和AKT磷酸化、凋亡增殖生長(bcl-2,bax,CyclinD1,EGFR和ki-67)、血管新生(VEGF和CD34)及侵襲轉(zhuǎn)移(MMP-9,MMP-2,TIMP-2和E-cadherin)等指標(biāo)的相關(guān)性。
2.探討靶向阻斷CXCR1/2對胃癌生物學(xué)行為的影響及其機制建立體內(nèi)外Repertaxin(一種CXC
6、R1/2小分子特異性抑制劑,能阻斷CXCR1/2與其配體結(jié)合)靶向阻斷胃癌細(xì)胞CXCR1/2體系:Repertaxin單獨或聯(lián)合化療藥物5-氟尿嘧啶(fluorouracil,5-FU)應(yīng)用到培養(yǎng)的胃癌細(xì)胞MKN45和裸鼠成瘤模型中。
(1) MTT實驗、平板克隆形成實驗、流式細(xì)胞周期檢測及凋亡檢測觀察胃癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡情況變化;
(2)劃痕實驗、遷移實驗和侵襲實驗比較細(xì)胞遷移及侵襲性;
(3)
7、real-time-PCR檢測凋亡增殖生長(bcl-2,bax,CyclinD1,EGFR和ki-67)、血管新生(VEGF)及侵襲轉(zhuǎn)移(MMP-9,MMP-2,TIMP-2和E-cadherin)指標(biāo)的mRNA水平;
(4) Western-blotting檢測CXCR1/2、凋亡增殖生長(bcl-2,bax,CyclinD1,EGFR和ki-67)、血管新生(VEGF)及侵襲轉(zhuǎn)移(MMP-9,MMP-2,TIMP-2和E-
8、cadherin)指標(biāo)的蛋白表達(dá)以及ERK和AKT磷酸化;
(5)裸鼠成瘤實驗:觀察裸鼠體內(nèi)移植瘤生長情況;切取移植瘤,制作切片,觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài);TUNEL法檢測細(xì)胞凋亡情況。
3.探討CXCR1沉默和過表達(dá)對胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為的影響及機制
(1) RT-PCR和Western-blotting檢測CXCR1在胃黏膜正常細(xì)胞系GES-1及胃癌細(xì)胞系MKN28、MKN45、BGC823、SGC7901和AG
9、S中的表達(dá),篩選CXCR1低表達(dá)和高表達(dá)胃癌細(xì)胞株;
(2)構(gòu)建CXCR1干擾質(zhì)粒載體(pYr-1.1-CXCR1-shRNA)、過表達(dá)質(zhì)粒載體(pIRES2-ZsGreen1-CXCR1)及陰性對照質(zhì)粒載體;建立CXCR1沉默及過表達(dá)的穩(wěn)定轉(zhuǎn)染細(xì)胞系;
(3)為驗證未出現(xiàn)脫靶效應(yīng)(off-target effects):針對CXCR1干擾質(zhì)粒載體(pYr-1.1-CXCR1-shRNA),設(shè)計構(gòu)建干擾回復(fù)載體(pI
10、RES2-ZsGreen1-CXCR1-Mut),雙轉(zhuǎn)染胃癌細(xì)胞,進(jìn)行功能回復(fù)實驗;
(4) MTT實驗、平板克隆形成實驗和流式細(xì)胞周期檢測觀察癌細(xì)胞增殖、細(xì)胞周期和凋亡情況變化;
(5)劃痕實驗、遷移實驗和侵襲實驗比較細(xì)胞遷移及侵襲性;
(6) real-time-PCR檢測凋亡增殖生長(bcl-2,bax,CyclinD1,EGFR和ki-67)、血管新生(VEGF)及侵襲轉(zhuǎn)移(MMP-9,MMP-2,
11、TIMP-2和E-cadherin)指標(biāo)的mRNA水平;
(7) Western-blotting檢測CXCR1/2、凋亡增殖生長(bcl-2,bax,CyclinD1,EGFR和ki-67)、血管新生(VEGF)及侵襲轉(zhuǎn)移(MMP-9,MMP-2,TIMP-2和E-cadherin)指標(biāo)的蛋白表達(dá)以及ERK和AKT磷酸化;
(8)裸鼠成瘤實驗:觀察裸鼠體內(nèi)移植瘤生長情況;切取移植瘤,制作HE切片,觀察腫瘤細(xì)胞形態(tài)。
12、
結(jié)果:
1.CXCR1/2表達(dá)與胃癌的臨床病理參數(shù)具有相關(guān)性(1)CXCR1/2在胃癌組織中的表達(dá)高于對應(yīng)的癌旁組織,CXCR1/2的表達(dá)與年齡、性別和分化程度無關(guān),而與胃癌的侵襲深度、淋巴結(jié)轉(zhuǎn)移和TNM分期成正相關(guān)性。
(2)CXCR1/2的表達(dá)與pAKT、 pERK、Cyclin D1、EGFR、Bcl-2、微血管密度(MVD)、MMP-9和MMP-2的表達(dá)具有正相關(guān)性,但與AKT、ERK、Ki-67
13、、Bax、VEGF、TIMP-2和E-cadherin的表達(dá)不具有相關(guān)性。
2.Repertaxin靶向阻斷CXCR1/2改變胃癌生物學(xué)行為并增敏5-FU
(1)Repertaxin阻斷CXCR1/2能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和凋亡發(fā)生,阻止細(xì)胞增殖生長,抑制細(xì)胞遷移和侵襲;Repertaxin和5-FU聯(lián)合應(yīng)用效果更明顯。
(2) Repertaxin能降低ERK1/2和AKT磷酸化水平,Repertaxin和5
14、-FU聯(lián)合應(yīng)用效果更明顯。
(3) Repertaxin能抑制bcl-2、cyclin D1、EGFR、VEGF、MMP2和MMP9的表達(dá),而促進(jìn)bax、TIMP-2和E-cadherin的表達(dá);Repertaxin和5-FU聯(lián)合應(yīng)用效果更明顯。
3.CXCR1沉默和過表達(dá)能改變胃癌細(xì)胞生物學(xué)行為
(1)CXCR1干擾未出現(xiàn)脫靶效應(yīng)。
(2)CXCR1沉默能誘導(dǎo)細(xì)胞周期阻滯和細(xì)胞凋亡,降低細(xì)胞增殖
15、生長,抑制細(xì)胞遷移和侵襲;而CXCR1過表達(dá)則能促進(jìn)細(xì)胞分裂、增殖生長、細(xì)胞遷移和侵襲,降低瘤細(xì)胞凋亡比例。
(3)CXCR1沉默能降低ERK1/2和AKT磷酸化水平。
(4)CXCR1沉默能抑制bcl-2、cyclin D1、EGFR、VEGF、MMP2和MMP9的表達(dá),促進(jìn)bax和E-cadherin的表達(dá)。
結(jié)論:
1.化學(xué)趨化因子受體CXCR1/2在胃癌組織和胃癌細(xì)胞系中高表達(dá),發(fā)現(xiàn)CXC
16、R1/2表達(dá)與侵襲、轉(zhuǎn)移及TNM分期成正相關(guān)。
2.在胃癌中CXCR1/2與其配體結(jié)合能激活MAPK/ERK和PI3K/AKT信號通路,通過調(diào)節(jié)與凋亡增殖生長(Bcl-2、Bax、CyclinD1、EGFR和VEGF)、侵襲轉(zhuǎn)移(MMP-9、MMP-2、TIMP-2和E-cadherin)相關(guān)指標(biāo)中bcl-2、CyclinD1、EGFR、VEGF、MMP2和MMP9的上調(diào)以及bax、TIMP2和E-1cadherin的下調(diào),進(jìn)
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