LASP-1在HBX促肝癌細(xì)胞增殖和遷移中作用的研究.pdf

1、目的：探討乙肝病毒X蛋白能否通過(guò)上調(diào)LASP-1及其蛋白表達(dá)從而促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移。
　　 方法：(1)應(yīng)用脂質(zhì)體法將pcDNA3.1，pcDNA3.1-X分別轉(zhuǎn)染HepG2細(xì)胞。經(jīng)G418篩選，克隆，建立陰性對(duì)照的細(xì)胞模型HepG2-Mock和穩(wěn)定表達(dá)HBX的細(xì)胞模型HepG2-HBX。通過(guò)RT-PCR、Western blot方法對(duì)細(xì)胞模型中HBX mRNA及蛋白進(jìn)行檢測(cè)，分析細(xì)胞模型中HBX的表達(dá)情況。(2)采用RT

2、-PCR、Westernblot檢測(cè)HepG2-Mock和HepG2-HBX細(xì)胞中的LASP-1基因及蛋白的表達(dá)情況；采用免疫熒光檢測(cè)LASP-1蛋白在HepG2-Mock，HepG2-HBX細(xì)胞內(nèi)的分布；采用Western blot檢測(cè)PI-3K信號(hào)通路中的p-Akt蛋白的表達(dá)情況，運(yùn)用阻斷劑LY294002阻斷PI-3K信號(hào)通路的激活，檢測(cè)LASP-1蛋白的表達(dá)，明確PI-3K信號(hào)通路的激活在HBX促進(jìn)LASP-1表達(dá)的作用。(3)

3、構(gòu)建LASP-1的siRNA表達(dá)質(zhì)粒，并轉(zhuǎn)染HepG2-HBX細(xì)胞。轉(zhuǎn)染48h后，運(yùn)用Western blot檢測(cè)LASP-1蛋白的表達(dá)情況，明確siRNA對(duì)LASP-1蛋白的抑制效果。采用CCK-8實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)檢測(cè)HepG2-Mock，HepG2-HBX細(xì)胞的增殖情況，Transwell和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)方法觀察HepG2-Mock，HepG2-HBX細(xì)胞的遷移能力，明確HBx能否促進(jìn)肝癌細(xì)胞的增殖和遷移，及LASP-1蛋白在H

4、Bx促進(jìn)肝癌細(xì)胞增殖和遷移中的作用。
　　 結(jié)果：(1)經(jīng)RT-PCR、Western blot檢測(cè)證實(shí)穩(wěn)定轉(zhuǎn)染的細(xì)胞中含有HBX基因的表達(dá)，并且穩(wěn)定表達(dá)HBX使HepG2的形態(tài)發(fā)生變化，出現(xiàn)了細(xì)長(zhǎng)的偽足，并且出現(xiàn)了數(shù)量較多的多核細(xì)胞。(2)RT-PCR、Western blot證實(shí)與HepG2-Mock細(xì)胞相比，HepG2-HBX細(xì)胞的LASP-1基因及蛋白的表達(dá)增加(P＜0.05)。免疫熒光的結(jié)果顯示，與HepG2-Mock

5、細(xì)胞相比，LASP-1蛋白在HepG2-HBX細(xì)胞內(nèi)的胞漿，偽足區(qū)域，多核細(xì)胞的核周表達(dá)增多。(3)Western blot結(jié)果顯示，與HepG2-Mock細(xì)胞相比，HepG2-HBX細(xì)胞中的p-Akt蛋白的表達(dá)增多（P＜0.05），運(yùn)用阻斷劑LY294002阻斷PI-3K信號(hào)通路的激活后，HepG2-HBX細(xì)胞內(nèi)的LASP-1蛋白表達(dá)降低(P＜0.05)。(4)LASP-1的siRNA表達(dá)質(zhì)粒構(gòu)建成功后轉(zhuǎn)染HepG2-HBX細(xì)胞；經(jīng)W

6、estern blot檢測(cè)，HepG2-HBX細(xì)胞的LASP-1蛋白表達(dá)明顯降低（P＜0.05）。
　　 (5) CCK-8增殖實(shí)驗(yàn)、平板克隆形成實(shí)驗(yàn)結(jié)果顯示，與HepG2-Mock細(xì)胞相比，HepG2-HBX細(xì)胞的增殖能力增加，經(jīng)siRNA降低LASP-1的表達(dá)后，HepG2-HBX細(xì)胞的增殖能力減弱。Transwell和劃痕愈合實(shí)驗(yàn)的結(jié)果表明，與HepG2-Mock細(xì)胞相比，HepG2-HBX細(xì)胞的遷移能力增加，經(jīng)siRNA

7、降低LASP-1的表達(dá)后，HepG2-HBX細(xì)胞的遷移能力減弱。
　　 結(jié)論：(1)本實(shí)驗(yàn)成功建立了穩(wěn)定表達(dá)HBX的HepG2-HBX細(xì)胞模型。穩(wěn)定表達(dá)的HBX使HepG2細(xì)胞的形態(tài)發(fā)生變化，多核細(xì)胞的數(shù)目增多。(2)HBX能上調(diào)LASP-1蛋白的表達(dá)，并且使LASP-1蛋白在胞漿，偽足區(qū)域，多核細(xì)胞的核周表達(dá)增多。(3)HBX促進(jìn)LASP-1的表達(dá)與PI-3K信號(hào)通路的激活有關(guān)。(4)HBX能通過(guò)上調(diào)LASP-1的表達(dá)而促進(jìn)肝